دوره 30، شماره 4 - ( 10-1400 )                   جلد 30 شماره 4 صفحات 289-276 | برگشت به فهرست نسخه ها


XML English Abstract Print


Download citation:
BibTeX | RIS | EndNote | Medlars | ProCite | Reference Manager | RefWorks
Send citation to:

Evazalipour M, Aghajani Torshkooh F, Jafari-Shakib R, Gholampour S, Zamani E. In Vitro Evaluation of Protective Effect of Rutin on Acrylamide-Induced Cellular Senescence in NIH3T3 Cells. JGUMS 2022; 30 (4) :276-289
URL: http://journal.gums.ac.ir/article-1-2402-fa.html
عوضعلی پور مهدی، آقاجانی ترشکوه فروغ، جعفری شکیب رضا، غلام پور سایه، زمانی احسان. بررسی برون‌تن اثر محافظتی روتین بر فرایند پیری اکسیداتیو القا شده با آکریل آمید در سلول‌های فیبروبلاست جنینی موش (NIH3T3). مجله علوم پزشکی گیلان. 1400; 30 (4) :276-289

URL: http://journal.gums.ac.ir/article-1-2402-fa.html


1- گروه بیوتکنولوژی دارویی، دانشکده داروسازی، دانشگاه علوم‌پزشکی گیلان، رشت، ایران.
2- گروه فارماکولوژی و سم‌شناسی، دانشکده داروسازی، دانشگاه علوم‌پزشکی گیلان، رشت، ایران.
3- گروه ایمنی‌شناسی، دانشکده پزشکی، دانشگاه علوم‌پزشکی گیلان، رشت، ایران.
4- گروه فارماکولوژی و سم‌شناسی، دانشکده داروسازی، دانشگاه علوم‌پزشکی گیلان، رشت، ایران. ، zamani2246@gmail.com
متن کامل [PDF 6067 kb]   (431 دریافت)     |   چکیده (HTML)  (1440 مشاهده)
متن کامل:   (552 مشاهده)
مقدمه
پس از تکامل و بلوغ سلول‌ها، پیری اتفاق می‌افتد. به این معنی که تقسیم سلول‌های بالغ عمدتاً به دلیل عدم وجود تکثیر DNA و تغییرات غیر معمول در بیان ژن متوقف می‌شود، در حالی‌ که آن‌ها از نظر متابولیکی فعال هستند [1]. شواهدی وجود دارد که نقش کلیدی تولید داخل سلولی گونه‌های اکسیژن فعال (ROS) را در القای پیری سلولی نشان می‌دهد [2 ,3]. آکریل آمید یک ترکیب شیمیایی صنعتی مورداستفاده در زمینه‌های مختلف مانند تهویه خاک، صنایع نساجی، کاغذ و لوازم آرایشی است [4].
 اخیراً، سطوح مختلف آکریل آمید در غذاهای دارای کربوهیدرات بالا که در دمای بالای 120 درجه طبخ می‌شوند، گزارش شده است که توجه به بررسی مسمومیت و مسیرهای بیماری‌زایی آن‌را افزایش داده است. از سوی دیگر، چندین مطالعه نشان داد آکریل آمید می‌تواند باعث ایجاد سمیت عصبی، سمیت باروری ، سمیت ژنتیکی، سمیت ایمنی و سرطان‌زایی در رده‌های سلولی یا مدل‌های حیوانی شود [5]. چندین آزمایش از استرس اکسیداتیو به‌عنوان یکی از مهم‌ترین مکانیسم های سمیت آکریل آمید نام برده‌اند [6 ،5].
عدم تعادل بین عوامل اکسیدکننده و آنتی اکسیدان ناشی از انتشار رادیکال‌های آزاد و گونه‌های اکسیژن فعال منجر به استرس اکسیداتیو و آسیب‌های ناشی از آن می‌شود [7]. آنتی اکسیدان‌ها می‌توانند آسیب اکسیداتیو را کاهش داده و از جهش‌زایی، سرطان‌زایی و پیری عمدتاً به دلیل فعالیت مهارکننده رادیکال جلوگیری کنند [8]. 
به هر ماده‌ای که سبب مهار یا به تأخیر افتادن آسیب‌های اکسیداتیو در ملکول هدف باشد، آنتی اکسیدانت می‌گویند. بدن انسان دارای چندین مکانیسم برای مقابله با آسیب ناشی از استرس اکسیداتیو می‌باشد [9]. آنتی‌اکسیدان‌ها ترکیباتی هستند که می‌توانند با مسدود کردن مسیرهای تشکیل رادیکال آزاد یا جلوگیری از آسیب رادیکال‌های آزاد از طریق چندین مکانیسم از اکسیداسیون جلوگیری کنند و یا آن ‌را به تعویق اندازند [10]. ترکیبات آنتی‌اکسیدانی طبیعی مانند فلاونوئیدها، اسیدهای فنولیک، کاروتنوئیدها، پلی ساکاریدها، و توکوفرول‌ها با حذف رادیکال‌های آزاد نقش کاهش‌دهنده را بازی می‌کنند [11]. بنابراین، نقش فیزیولوژیکی این ترکیبات، محافظت از اجزای سلولی در برابر آسیب واکنش‌های شیمیایی ناشی از رادیکال‌های آزاد می‌باشد [10].
روتین(3، 30، 40، 5، 7-پنتاهیدروکسی فلاون-3-رامنوگلوکزید)، یک فلاونول است که به وفور در گیاهانی از قبیل گندم سیاه، چای و سیب یافت می‌شود [12]. روتین، فعالیت‌های دارویی زیادی از خود نشان می‌دهد، از جمله آن‌ها اثرات آنتی‌باکتریال، ضدتومور، ضدالتهاب، ضداسهال، ضدزخم، ضدموتاژنیسیته، محافظ عضله قلبی، بازکننده عروق و تعدیل کننده سیستم ایمنی و محافظت کبدی می‌باشند [11]. در مطالعات مشاهده شده است نیمی از ذخایر روتین از لایه اپیدرم بالایی برگ گیاه گندم سیاه به دست می‌آید. غلظت روتین بلافاصله پس از تابش فرابنفش افزایش می‌یابد [11]. این یافته نشان می‌دهد روتین نقش مهمی در زمان تابش فرابنفش دارد و این یکی از نشانه‌هایی است که می‌تواند ثابت کند فلاونوئیدها نقش محافظت از سلول در برابر تابش فرابنفش  دارند. از سوی دیگر، فعالیت برخی پراکسیدازها مانند روتین گلیکوزیداز در شرایط استرس، سلول را از آسیب‌های اکسیداتیو محافظت می‌کند [11]. مطالعات زیادی اثرات آنتی‌اکسیدانتی روتین را نشان داده‌اند [13]. به‌عنوان مثال: مطالعات نشان می‌دهد روتین از طریق فعالیت آنتی‌اکسیدانتی و با تنظیم بیان ژن‌های آنتی‌اکسیدانت از قبیل پارااکسناز-1 و گلوتاتیونS- ترانسفراز موجب بهبود سمیت کبدی در موش‌های ویستار با کلسترول بالا می‌شود [14] در مطالعه‌ای دیگر روتین موجب کاهش استرس اکسیداتیو، آپوپتوز و التهاب ناشی از تتراکلرید کربن در موش می‌شود [15]. همچنین مطالعات زیادی مؤید نقش مؤثر روتین (به علت اثرات آنتی‌اکسیدانتی) در جلوگیری از ایسکمیک در بافت‌های مختلف می‌باشد [16 ،12] . 
سلول‌های فیبروبلاستِ جنینی موش را در تمام بافت‌های موجود در موش می‌توان مشاهده کرد. این سلول‌ها نقش مهمی در رشد و توسعه اندام‌ها دارند. بنابراین، در مطالعات برون‌تنی مربوط به پیری سلولی و نیز مطالعات بررسی چرخه سلول از سلول‌های فیبروبلاست به‌عنوان مدل استفاده می‌شود (17).  بر این اساس، مطالعه حاضر با هدف بررسی توانایی احتمالی آکریل آمید در القا استرس اکسیداتیو و پیری سلولی و نیز برای بررسی اثرات روتین در کاهش پیری سلولی ناشی از آکریل آمید در رده سلولی فیبروبلاست جنینی (NIH3T3) انجام شده است. 
روش‌ها
مواد شیمیایی
روتین (سیگما، خلوص98) و آکریل آمید (سیگما، A 8887، خلوص ≤ 98) از شرکت شیمیایی سیگما (سنت لوئیس، ایالات متحده آمریکا) خریداری شد. تمامی مواد و معرف‌های دیگر استفاده شده در این مطالعه از درجه دارویی و یا HPLC شرکت مرک تهیه شد.
کشت سلولی 
در این مطالعه آزمایشگاهی، سلول‌های فیبروبلاست جنینی موش مورد استفاده قرار گرفت. این سلول‌ها به‌عنوان یک مدل مهم و کارا در بسیاری از مطالعات سم‌شناسی قابل استفاده می‌باشد [17]. سلول‌های فیبروبلاست جنینی موش رده سلولی (NIH3T3) از انستیتو پاستور ایران تهیه شد. این سلول‌ها در محیط کشت سلولی DMEM-HG  و انکوباتور با دمای 37 درجه و CO2 5 درصد تکثیر شدند. پس از سومین پاساژ، سلول‌های تکثیر یافته در فلاسک به پلیت‌های 96 خانه (برای تست MTT) و پلیت‌های 6 خانه (برای سنجش بتا گالاکتوزیداز و استرس اکسیداتیو) منتقل و به ترتیب با تعداد 104 × 2 و 105 × 2 سلول کشت داده شدند. نمونه‌های آزمایشگاهی به صورت گروه‌های زیر طبقه‌بندی شدند: 
گروه کنترل: سلول‌های NIH3T3 در محیط کشت DMEM-HG و دریافت‌کننده حلال (PBS به همراه حداکثر 1 درصد DMSO) 
گروه کنترل مثبت: H2O2 با غلظت 400 میکرومولار (به مدت 2 ساعت) [11]
گروه آکریل آمید: IC50 آکریل آمید (به مدت 2 ساعت) [18]
گروه روتین + آکریل آمید: حداقل غلظت موثر (براساس پری تست و مقالات مشابه [1920]) روتین به همراه IC50 آکریل آمید
گروه H2O2+ روتین: H2O2 به همراه حداقل غلظت موثر روتین.
ارزیابی سمیت سلولی با روش MTT
برای ارزیابی سمیت سلول‌های تحت درمان، از روش MTT استفاده شد. بدین منظور سلول‌ها با غلظت‌های مختلف روتین (10، 25، 50 و 100 میکرو مولار) به مدت 24 ساعت تحت تیمار قرار گرفتند [20]. تیمار سلول با آکریل آمید و H2O2  به مدت 2 ساعت انجام شد. پس از انکوباسیون، سلول‌ها دو بار با استفاده از PBS شست‌شو شدند. سپس محلول MTT اضافه شد و انکوباسیون مجدد در دمای 37 درجه سانتی‌گراد انجام شد. در مرحله بعد پلیت تخلیه و 150 میکرولیتر محلول DMSO به هرچاهک اضافه شد. در نهایت میزان جذب نوری با دستگاه خوانش میکروپلیت در طول موج 570 نانومتر خوانده شد. قابلیت زنده ماندن تمام گروه‌های تحت تیمار در مقایسه با گروه کنترل (100 درصد در نظر گرفته شد) گزارش شد [21].
ارزیابی میزان بروز فرایند پیری
شناسایی کیفی فعالیت آنزیم بتاگالاکتوزیداز مرتبط با پیری (SA-β-gal1)  

فعالیت آنزیم بتاگالاکتوریداز فقط در سلول‌های پیر شده قابل تشخیص است. تشخیص این فعالیت وابسته به pH است و ارزیابی این فعالیت در pH6 انجام شده است [22]. در این مطالعه، سلول‌ها در پلیت‌های 6 خانه کشت داده شدند و برطبق گروه‌هایی که قبلاً ذکر شد طبقه‌بندی شدند. پس از آن، سلول‌ها با استفاده از PBS دو بار شست‌شو داده شدند و سپس محلول تثبیت‌کننده (20 درصد فرمالدئید 2 درصد گلوتارآلدئید) به آن اضافه شد و به مدت 5 دقیقه در درجه حرارت اتاق انکوبه شدند. در مرحله بعد، محلول تثبیت‌کننده حذف شد و سلول‌ها دوبار با PBS شست‌شو داده شدند. سپس آن‌ها با رنگ‌آمیزی گالاکتوزیداز رنگ‌آمیزی و در دمای 37 درجه سانتی‌گراد در طول شب (12 تا 16 ساعت) انکوبه شدند. سلول‌ها در زیر میکروسکوپ نوری با بزرگ‌نمایی 200x مورد بررسی قرار گرفتند. مشاهده رنگ آبی مایل به سبز تأییدکننده وجود سلول‌های پیر می‌باشد  [22].
شناسایی کّمی فعالیت آنزیم بتاگالاکتوزیداز مرتبط با پیری (SA-β-gal) 
 از کیت گالاکتوزیداز مخصوص موش برای تعیین فعالیت آنزیم بتاگالاکتوزیداز در سلول‌های جنینی موش استفاده شد. 100 میکرولیتر استاندارد موجود در کیت با نمونه سوسپانسیون سلولی به هر چاهک اضافه شد و سپس به مدت 2 ساعت در دمای 37 درجه سانتی‌گراد انکوبه شدند. پس از خارج کردن مایع از هر چاهک، 100 میکرولیتر آنتی‌بادی بیوتینه اضافه شد. سپس انکوباسیون به مدت 1 ساعت در دمای 37 درجه سانتی‌گراد انجام شد. چاهک‌ها تخلیه و شست‌شو شدند. سپس 100 میکرولیترHRP-avidin (X1)  به هر چاهک اضافه شد و به دنبال آن انکوباسیون دیگری به مدت 1ساعت در دمای 37 درجه سانتی‌گراد انجام شد. سپس، دوباره مراحل تخلیه و شست‌شو انجام شد و 90 میکرولیتر تترامتیل بنزیدینبه هر چاهک اضافه شد و آن‌ها در 37 درجه سانتی‌گراد به مدت 30 دقیقه در مکانی تاریک انکوبه شدند. در نهایت، 50 میکرولیتر محلول توقف به هر چاهک اضافه شد و میزان جذب نوری در طول موج 450 نانومتر با دستگاه خوانش میکروپلیت خوانده شد. 
اندازه گیری پارامترهای مرتبط با استرس اکسیداتیو
ارزیابی لیپید پراکسیداسیون

برای بررسی میزان آسیب اکسیداتیو به غشاهای لیپیدی، غلظت محصول نهایی پراکسیداسیون لپیدی، مالون‌دی‌آلدهید از طریق روش تیوباربیتوریک اسید مورد ارزیابی قرار گرفت. در این روش، سلول‌‌ها همگن و با 800 میکرولیتر اسید تری کلرواستیک مخلوط شدند و با دور 1500 g به مدت 30 دقیقه سانتریفیوژ شدند. سپس 150 میکرولیتر تیوباربیتوریک اسید به مایع ‌رویی اضافه شد و مخلوط به مدت 15 دقیقه در حمام آب جوش قرار داده شد. سپس 400 میکرولیتر ان-بوتانول به آن اضافه شد و در نهایت میزان جذب در طول موج 532 نانومتر با استفاده از دستگاه خوانش میکروپلیت خوانده شد [23].
 اندازه گیری محتوای گلوتاتیون
تری پپتید گلوتاتیون یکی از مهم‌ترین آنتی‌اکسیدانت‌های ذاتی سلول‌ها است. چنانچه به هر دلیلی سطح آن در سلول کاهش یابد، نشان‌دهنده بروز آسیب استرس اکسیداتیو در سلول است [23]. در این مطالعه، برای اندازه‌گیری غلظت گلوتاتیون سلولی، ابتدا سلول‌ها با استفاده از یک هموژنایزر مکانیکی شیشه‌ای همگن شدند. هموژن سلولی با بافر Tris-EDTA مخلوط شد و به آن DTNB افزوده شد و به مدت 15 دقیقه در دمای اتاق در مکانی تاریک انکوبه شد. سپس سانتریفیوژ در دور 3000g به مدت 15 دقیقه انجام شد و جذب مایع‌ رویی با دستگاه اسپکتروفتومتردر طول موج 412 نانومتر خوانده شد.
تحلیل آماری
نتایج بر حسب میانگین±انحراف معیار با حداقل سه بار تکرار گزارش شد. آنالیزهای آماری با استفاده از نرم‌افزار GraphPad Prism نسخه 8 و تحلیل واریانس یک‌طرفه تجزیه و تحلیل و در صورت معناداری اختلاف از آزمون تعقیبی توکی استفاده می‌شود. سطح معناداری 0/05 در نظر گرفته شد.
یافته‌ها
نتایج ارزیابی سمیت سلولی

همان‌طور که در تصویر شماره 2 نشان داده شده است، آکریل آمید توانست به‌طور قابل توجهی زنده ماندن سلول‌ها را در مقایسه با گروه کنترل کاهش دهد (001/P<0).

روتین در همه غلظت‌ها زنده ماندن سلول‌های تحت درمان با آکریل آمید را نسبت به گروه آکریل آمید افزایش داد (05/P<0). همان‌طور که اطلاعات نشان می‌دهد،  H2O2  به عنوان کنترل مثبت نیز زنده ماندن سلول‌ها را به صورت معنادار نسبت به گروه کنترل کاهش داد (05/P<0). بر اساس نتایج به‌دست آمده از MTT با توجه به این که بیشترین اثر محافظتی در غلظت 50 میکرومولار روتین مشاهده شد، این غلظت به‌عنوان غلظت مؤثر در سایر تست‌ها مورد استفاده قرار گرفت (تصویر شماره 1). 

نتایج ارزیابی میزان بروز فرایند پیری
نتایج ارزیابی کیفی فعالیت آنزیم بتاگالاکتوزیداز مرتبط با پیری (SA-β-gal)

همان‌طور که گفته شد فعالیت آنزیم بتا گالاکتوزیداز یکی از بیواندیکاتورهای مهم در سنجش میزان پیری سلول‌ها می‌باشد و میزان آن در سلول‌های پیر شده، افزایش می‌یابد. به دنبال بررسی کیفی سلول‌ها با میکروسکوپ نوری و همان‌طور که در تصویر شماره 1 مشخص شده است، تجمع بیشتر رنگ سبز-آبی در سلول‌های تحت درمان با آکریل آمید و H2O2 (مشخص شده با فلش توخالی) در مقایسه با گروه کنترل مشاهده می‌شود که نشانگر افزایش در سطح فعالیت بتا گالاکتوزیداز می‌باشد. از طرف دیگر، تیمار سلول‌ها با روتین، موجب کاهش سطح فعالیت گالاکتوزیداز و در نتیجه کاهش تجمع رنگ شده است که این تغییر در گروه‌های روتین+آکریل آمید و روتین+H2O2  قابل مشاهده می‌باشد (تصویر شماره 2).
نتایج ارزیابی فعالیت کمی آنزیم بتاگالاکتوزیداز مرتبط با پیری (SA-β-gal)
شناسایی کّمی فعالیت بتا گالاکتوزیداز در گروه‌های آزمایشی مختلف در نمودار تصویر شماره 3 نشان داده شده است.

بررسی فعالیت آنزیم بتاگالاکتوزیداز نشان داد گروه آکریل آمید و  H2O2 دارای اختلاف معنادار با گروه کنترل (05/P<0) است که نشان‌دهنده اثر القایی آن در فرایند پیری سلولی می‌باشد. خوشبختانه تیمار سلول‌ها با روتین (در گروه روتین+آکریل آمید) به شکل چشمگیری این فعالیت را نسبت به گروه تحت تیمار با آکریل آمید به تنهایی کاهش داد (05/P<0) و بیانگر این موضوع است که روتین می‌تواند در فرایند پیری اثر محافظتی داشته باشد (تصویر شماره 3). 
نتایج اندازه گیری پارامترهای استرس اکسیداتیو
نتایج آزمایش لیپید پراکسیداسیون 

یکی از پارامترهای بررسی استرس اکسیداتیو در این مطالعه بررسی میزان لیپید پراکسیداسیون در سلول‌های فیبروبلاست جنینی موش بعد از تماس با آکریل آمید می‌باشد. براساس تصویر شماره 4، با اندازه‌گیری میزان مالون‌دی‌آلدهید که محصول نهایی لیپید پراکسیداسیون می‌باشد، مشخص شد تماس با آکریل آمید و H2O2 موجب افزایش MDA1 در سلول‌های فیبروبلاست جنینی موش می‌شود.

در گروه‌های روتین+آکریل آمید و روتین+  H2O2 میزان MDA به طور معناداری کمتر از گروه آکریل آمید به تنهایی و H2O2 به تنهایی بود (05/P<0) (تصویر شماره 4). 
نتایج اندازه‌گیری محتوای گلوتاتیون
یکی دیگر از پارامترهای مورد ارزیابی در این مطالعه سطح گلوتاتیون سلولی در سلول‌های فیبروبلاست جنینی موش بود .
با توجه به تصویر شماره 5، یافته‌ها نشان می‌دهد گروه آکریل آمید و گروه H2O2  به صورت معنادار (05/P<0)، سطح گلوتاتیون کمتری را نسبت به گروه کنترل دارد.

استفاده از روتین+آکریل آمید نسبت به گروه آکریل آمید به‌طور چشمگیری موجب بهبود این آسیب شد و سطح گلوتاتیون بالاتری را موجب شد (05/P>0). مشابه این اتفاق در گروه‌های تحت درمان با H2O2 و روتین+ H2O2 مشاهده شد (05/P<0) (تصویر شماره 5). 
بحث و نتیجه گیری
پیری یک فرایند ذاتی و پیشرو است که همراه با تجمع تدریجی آسیب‌های مختلف و کاهش کارایی عملکردی و هموستاز در سلول‌ها و بافت‌ها در طول زمان است [24]. پیری سلولی ناشی از استرس اکسیداتیو یک حالت پایدار توقف چرخه سلولی است که در تکثیر سلول‌ها به‌عنوان پاسخی به شرایط استرس‌زا اتفاق می‌افتد. در سلول‌های پیر شده توقف تقسیم سلولی، مقاومت در آپوپتوز و اصلاح الگوی بیان ژن دیده می‌شود [25]. این مطالعه نشان داد آکریل آمید یک القاکننده برون‌زای پیری سلولی می‌باشد که این اتفاق از طریق بررسی کّمی و کیفی فعالیت آنزیم بتاگالاکتوزیداز ارزیابی شد. همچنین بر اساس این مطالعه، استرس اکسیداتیو به‌عنوان یک مکانیسم مهم در القای پیری در سلول‌های فیبروبلاست جنینی موشNIH3T3  مطرح شد. از طرف دیگر، مشخص شد روتین (یک آنتی‌اکسیدانت قوی) می‌تواند با مهار آسیب اکسیداتیو پیری، از پیری جلوگیری کند. 
در بسیاری از مطالعات پیری سلولی در چندین رده سلولی مورد تحقیق قرار گرفته است. فعالیت بتا گالاکتوزیداز در سلول‌های نامیرا مانند سلول‌های سرطانی غیر قابل تشخیص است مگر اینکه این سلول‌ها برای سنجش پیری با روش‌های ژنتیکی یا شیمیایی دستکاری شوند [2122]. فیبروبلاست‌های جنینی برای ارزیابی پیری سلولی مناسب هستند، زیرا آن‌ها در همه اندام‌های حیوانات در دسترس هستند و به‌عنوان یک مدل در بررسی‌های مربوط به پیری سلولی مورد استفاده قرار می‌گیرند [22]. پیری یک فرایند پیشرو است که همراه با تجمع تدریجی آسیب‌های مختلف، کاهش کیفیت عملکرد و هموستاز سلول‌ها و بافت‌ها در طول زمان است [27 ،26]. پیری سلولی نقش کلیدی در پیری و بیماری‌های مربوط به سن دارد [28]. اندازه‌گیری آنزیم بتاگالاکتوزیداز در پیری از زیست‌نشانگرهای مهم برای سنجش پیری در سلول‌های پستانداران می‌باشد [29]. آنزیم بتاگالاکتوزیداز در سلول‌های دچار پیری شده در pH6 فعال می‌باشد [30]. در مطالعات برون‌تن و درون‌تن، روش SA-β-gal به‌طور گسترده‌ای به‌عنوان زیست‌نشانگر مهم در تشخیص پیری سلولی مورداستفاده قرار گرفته است [31]. در مطالعه حاضر، فعالیت بتاگالاکتوزیداز با استفاده از روش‌های کّمی و کیفی اندازه‌گیری شد [22]. این نتایج مشابه مطالعه قبلی هستند که نشان داد آکریل آمید فعالیت گالاکتوزیداز و القا و پیری در سلول‌های اندوتلیال رگ ناف انسان را افزایش می‌دهد [32]. در این مطالعه نیز فعالیت آنزیم بتاگالاکتوزیداز در سلول‌های تیمار شده با آکریل آمید و H2O2  افزایش یافت. همچنین این دو گروه بیشترین و گروه‌های کنترل و گروه‌های تحت درمان با روتین کمترین میزان رنگ‌‌پذیری را داشتند. 
در حال حاضر، عوامل زیادی در رابطه با بروز فرآیند پیری سلولی مطرح است که از مهم‌ترین آن می‌توان به استرس اکسیداتیو اشاره کرد. گونه‌ی فعال اکسیژن و رادیکال‌های آزاد با ایجاد تغییرات در بیان یک‌ سری ژن‌ها و مسیرهای هدایت پیام منجر به پیری سلول می‌شوند. بنابراین استرس اکسیداتیو نقش مهمی در بروز پدیده پیری ایفا می‌کند [33]. میتوکندری‌ها به‌عنوان یکی از مهم‌ترین منابع تولید رادیکال‌های آزاد می‌باشند و به آسیب‌های ناشی از استرس اکسیداتیو نیز بسیار حساس می‌باشند [34]. مطالعات نشان می دهند آسیب اکسیداتیو به میتوکندری‌ها موجب القای پیری سلولی و توقف تکثیر سلولی شده و نقش مهمی در بروز پیری سلولی دارد [35 ،34]. در این مطالعه پارامترهای آسیب اکسیداتیو از قبیل میزان لیپید پراکسیداسیون و سطح گلوتاتیون مورد ارزیابی قرار گرفت. در یک مطالعه مشخص شد رادیکال‌های آزاد با افزایش سطح مالون دی آلدهید نقش مهمی در پیری مغز در مغز موش‌های مسن دارند [36]. این مطالعه نشان داد آکریل آمید می‌تواند سطح لیپید پراکسیداسیون را افزایش دهد که به خواص القاکنندگی استرس اکسیداتیو این ترکیب نسبت داده می‌شود [37، 38]. درمان با روتین به‌طور مؤثر سطح لیپید پراکسیداسیون در گروه‌های روتین+آکریل آمید و روتین+H2O2 را کاهش داد که نشان‌دهنده نقش آنتی اکسیدانتی روتین در پیشگیری از فرایند پیری ناشی از آکریل آمید می‌باشد. 
براساس مطالعه ساستر و همکاران، غلظت گلوتاتیون در سلول‌های دچار پیری کاهش می‌یابد [39]. موجودات مانند پشه، مگس خانگی بالغ، مگس میوه، موش، موش صحرایی و انسان‌ها تنها چند نمونه از موجوداتی هستند که در آن‌ها سطح گلوتاتیون به صورت وابسته به سن کاهش می‌یابد [40]. یک رابطه منفی بین غلظت گلوتاتیون در مایع مغزی نخاعی و سن مشاهده شده است [41] که نشان‌دهنده نقش کلیدی سطوح گلوتاتیون در روند پیری است. در این مطالعه، گروه‌های سلولی تحت تیمار با آکریل آمید و H2O2 هر دو کاهش سطح گلوتاتیون را نشان دادند که با سایر مطالعات مشابه موافق است [41 ،40]. به‌عنوان مثال، مطالعه‌ای روی عملکرد ایمنی موش‌ها گزارش شد که آکریل آمید توانست سمیت ایمنی را از طریق کاهش غلظت گلوتاتیون (و افزایش پراکسیداسیون لیپید) در طحال موش‌ها موجب شود [42]. نقش استرس اکسیداتیو در سمیت ناشی از آکریل آمید در سایر مطالعات ثابت شده است [43 ،37، 38]. 
اثرات آنتی اکسیدانتی روتین در مقالات مختلف تأیید شده است و با توجه به داشتن خاصیت جاروب‌کنندگی رادیکال‌های آزاد می‌تواند رادیکال‌های آزاد را خنثی کرده و از اثرات مضر استرس اکسیداتیو در بدن بکاهد [44 ،13]. در این مطالعه، نشان داده شد روتین با کاهش لیپید پراکسیداسیون و افزایش غلظت گلوتاتیون در سلول‌های فیبروبلاست جنینی موش، نقش مهمی در حفاظت علیه پیری ناشی از آکریل آمید دارد. روتین یک محصول طبیعی با سابقه اثبات شده از تجویز ایمن برای انسان می‌باشد. بنابراین، می‌تواند به‌عنوان یک جایگزین امیدوارکننده برای درمان بالینی در مشکلاتی از قبیل پیری در نظر گرفته شود.
 این مطالعه نشان داد آکریل آمید می‌تواند باعث پیری در سلول‌های فیبروبلاست جنینی موش (NIH3T3) شود. استرس اکسیداتیو نقش مهمی در شروع پیری سلول ایفا کرد. علاوه بر این، نتایج نشان داد روتین می‌تواند به‌طور مؤثر پیری سلول را در سلول NIH3T3 از طریق کاهش استرس اکسیداتیو کاهش دهد، زیرا روتین یک ترکیب طبیعی با ایمنی تأیید شده در انسان است. اثرات مفید روتین ممکن است در کاهش عوارض جانبی آلودگی‌های غذایی مانند سمیت آکریل آمید در انسان مفید باشد.

ملاحظات اخلاقی
پیروی از اصول اخلاق پژوهش

در این مطالعه کلیه اصول و استانداردهای کمیته ملی اخلاق رعایت شده است. این طرح در کمیته اخلاق دانشگاه علوم‌پزشکی گیلان با کد IR.GUMS.REC.1397.413 به ثبت رسیده است. 

حامی مالی
پژوهش حاضر با حمایت معاونت تحقیقات و فناوری دانشگاه علوم‌پزشکی گیلان انجام شده است.

مشارکت نویسندگان
تمامی نویسندگان حاضر استحقاق کافی برای حضور در این مقاله را داشته و در محتوای ارائه شده مسئولیت داشتند. طراحی تحقیق: احسان زمانی و مهدی عوضعلی‌پور؛ اجرای روش‌های: احسان زمانی و رضا جعفری شکیب و مهدی عوضعلی پور؛ اجرای روش کار: فروغ آقاجانی ترشکوه و سایه غلامپور؛ نگارش پیش نویس اولیه: احسان زمانی و فروغ آقاجانی ترشکوه؛ ویرایش و اصلاح مقاله: مهدی عوضعلی پور و احسان زمانی.

تعارض منافع
نویسندگان هیچ‌گونه تعارض منافعی در این پژوهش نداشته‌اند.

تشکر و قدردانی
این پژوهش به‌عنوان بخشی از طرح پایان‌نامه دکترای خانم سایه غلامپور و با حمایت معاونت تحقیقات دانشگاه علوم‌پزشکی گیلان انجام شده است که از معاونت تحقیقات و فناوری دانشگاه علوم‌پزشکی گیلان تشکر می‌کنیم .


References
1.Trougakos IP, Saridaki A, Panayotou G, Gonos ES. Identification of differentially expressed proteins in senescent human embryonic fibroblasts. Mechanisms of Ageing and Development. 2006; 127(1):88-92. [DOI:10.1016/j.mad.2005.08.009] [PMID]
2.Kujoth GC, Hiona A, Pugh TD, Someya S, Panzer K, Wohlgemuth SE, et al. Mitochondrial DNA mutations, oxidative stress, and apoptosis in mammalian aging. Science. 2005; 309(5733):481-4. [DOI:10.1126/science.1112125] [PMID]
3.Lu T, Finkel T. Free radicals and senescence. Experimental Cell Research. 2008; 314(9):1918-22. [DOI:10.1016/j.yexcr.2008.01.011] [PMID] [PMCID]
4.Friedman M. Chemistry, biochemistry, and safety of acrylamide. A review. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 2003; 51(16):4504-26. [DOI:10.1021/jf030204+] [PMID]
5.Cao J, Liu Y, Jia L, Jiang LP, Geng CY, Yao XF, et al. Curcumin attenuates acrylamide-induced cytotoxicity and genotoxicity in HepG2 cells by ROS scavenging. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 2008; 56(24):12059-63. [DOI:10.1021/jf8026827] [PMID]
6.Jiang L, Cao J, An Y, Geng C, Qu S, Jiang L, et al. Genotoxicity of acrylamide in human hepatoma G2 (HepG2) cells. Toxicology in Vitro. 2007; 21(8):1486-92. [DOI:10.1016/j.tiv.2007.06.011] [PMID]
7.Jahani M, Shokrzadeh M, Vafaei-Pour Z, Zamani E, Shaki F. Potential role of cerium oxide nanoparticles for attenuation of diabetic nephropathy by inhibition of oxidative damage. Asian Journal of Animal and Veterinary Advances. 2016; 11(4):226-34. [DOI:10.3923/ajava.2016.226.234]                
8.Coccimiglio J, Alipour M, Jiang ZH, Gottardo C, Suntres Z. Antioxidant, antibacterial, and cytotoxic activities of the ethanolic Origanum vulgare extract and its major constituents. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2016; 2016:1404505. [DOI:10.1155/2016/1404505] [PMID] [PMCID]
9.Shahidi F, Zhong Y. Measurement of antioxidant activity. Journal of Functional Foods. 2015; 18(Pt B):757-81. [DOI:10.1016/j.jff.2015.01.047]
10.Young IS, Woodside JV. Antioxidant in health and disease. Journal of Clinical Patholology. 2001; 54(3):176-86. [DOI:10.1136/jcp.54.3.176] [PMID] [PMCID]
11.Ozsoy N, Candoken E, Akev N. Implications for degenerative disorders: Antioxidative activity, total phenols, flavonoids, ascorbic acid, β-carotene and β-tocopherol in Aloe vera. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2009; 2:315091. [DOI:10.4161/oxim.2.2.8493] [PMID] [PMCID]
12.Korkmaz A, Kolankaya D. Protective effect of rutin on the ischemia/reperfusion induced damage in rat kidney. Journal of Surgical Research. 2010; 164(2):309-15. [DOI:10.1016/j.jss.2009.03.022] [PMID]
13.Enogieru AB, Haylett W, Hiss DC, Bardien S, Ekpo OE. Rutin as a potent antioxidant: Implications for neurodegenerative disorders. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2018; 2018:6241017. [DOI:10.1155/2018/6241017] [PMID] [PMCID]
14.Al-Rejaie SS, Aleisa AM, Sayed-Ahmed MM, Al-Shabanah OA, Abuohashish HM, Ahmed MM, et al. Protective effect of rutin on the antioxidant genes expression in hypercholestrolemic male Westar rat. BMC Complementary and Alternative Medicine . 2013; 13:136. [DOI:10.1186/1472-6882-13-136] [PMID] [PMCID]
15.Ma JQ, Liu CM, Yang W. Protective effect of rutin against carbon tetrachloride-induced oxidative stress, inflammation and apoptosis in mouse kidney associated with the ceramide, MAPKs, p53 and calpain activities. Chemico-Biological Interactions. 2018; 286:26-33. [DOI:10.1016/j.cbi.2018.03.003] [PMID]
16.Wei SM, Yan ZZ, Zhou J. Protective effect of rutin on testicular ischemia-reperfusion injury. Journal of Pediatric Surgery. 2011; 46(7):1419-24. [DOI:10.1016/j.jpedsurg.2010.09.044] [PMID]
17.Evazalipour M, Safarzadeh Kozani P, Safarzadeh Kozani P, Shabani S, Rezaei Soufi B, Zamani E. Acrylamide induced oxidative cellular senescence in embryonic fibroblast cell line (NIH3T3): A protection by carvacrol. Jundishapur Journal of Natural Pharmaceutical Products. 2021; 16(4):e109399. [DOI:10.5812/jjnpp.109399]
18.Sahinturk V, Kacar S, Vejselova D, Kutlu HM. Acrylamide exerts its cytotoxicity in NIH/3T3 fibroblast cells by apoptosis. Toxicol and Industrial  Health. 2018; 34(7):481-9. [DOI:10.1177/0748233718769806] [PMID]
19.Magalingam KB, Radhakrishnan A, Haleagrahara N. Protective effects of quercetin glycosides, rutin, and isoquercetrin against 6-hydroxydopamine (6-OHDA)-induced neurotoxicity in rat pheochromocytoma (PC-12) cells. International Journal of Immunopathology and Pharmacology. 2016; 29(1):30-9. [DOI:10.1177/0394632015613039] [PMID] [PMCID]
20.Patil SL, Swaroop K, Kakde N, Somashekarappa HM. In vitro protective effect of rutin and quercetin against radiation-induced genetic damage in human lymphocytes. Indian of Journal Nuclear Medicine. 2017; 32(4):289-95. [DOI:10.4103/ijnm.IJNM_30_17] [PMID] [PMCID
21.Yoon S, Han S, Jeon KJ, Kwon S. Effects of collected road dusts on cell viability, inflammatory response, and oxidative stress in cultured human corneal epithelial cells. Toxicology Letters. 2018; 284:152-60. [DOI:10.1016/j.toxlet.2017.12.012] [PMID]
22.Baeeri M, Mohammadi-Nejad S, Rahimifard M, Navaei-Nigjeh M, Moeini-Nodeh S, Khorasani R, et al. Molecular and biochemical evidence on the protective role of ellagic acid and silybin against oxidative stress-induced cellular aging. Molecular and Cellular Biochemistry. 2018; 441(1):21-33. [DOI:10.1007/s11010-017-3172-0] [PMID]
23.Zamani E, Mohammadbagheri M, Fallah M, Shaki F. Atorvastatin attenuates ethanol-induced hepatotoxicity via antioxidant and anti-inflammatory mechanisms. Research in Pharmaceutical Sciences. 2017; 12(4):315-21. [DOI:10.4103/1735-5362.212049] [PMID] [PMCID]
24.Dorman HD, Surai P, Deans SG. In vitro antioxidant activity of a number of plant essential oils and phytoconstituents. Journal of Essential Oil Research. 2000; 12(2):241-8. [DOI:10.1080/10412905.2000.9699508]
25.Campisi J, Di Fagagna FDA. Cellular senescence: When bad things happen to good cells. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 2007; 8(9):729-40. [DOI:10.1038/nrm2233] [PMID]
26.Romano AD, Serviddio G, de Matthaeis A, Bellanti F, Vendemiale G. Oxidative stress and aging. Journal of Nephrology. 2010; 23 Suppl 15:S29-36. [PMID]
27.Viña J, Borrás C, Miquel J. Theories of ageing. IUBMB Life. 2007; 59(4-5):249-54. [DOI:10.1080/15216540601178067] [PMID]
28.van Deursen JM. The role of senescent cells in ageing. Nature. 2014; 509(7501):439-46. [DOI:10.1038/nature13193] [PMID] [PMCID]
29.Debacq-Chainiaux F, Borlon C, Pascal T, Royer V, Eliaers F, Ninane N, et al. Repeated exposure of human skin fibroblasts to UVB at subcytotoxic level triggers premature senescence through the TGF-β1 signaling pathway. Journal of Cell Science. 2005; 118(4):743-58. [DOI:10.1242/jcs.01651] [PMID]
30.Llana-Ruiz-Cabello M, Gutiérrez-Praena D, Puerto M, Pichardo S, Jos Á, Cameán AM. In vitro pro-oxidant/antioxidant role of carvacrol, thymol and their mixture in the intestinal Caco-2 cell line. Toxicology in Vitro. 2015; 29(4):647-56. [DOI:10.1016/j.tiv.2015.02.006] [PMID]
31.Itahana K, Campisi J, Dimri GP. Mechanisms of cellular senescence in human and mouse cells. Biogerontology. 2004; 5(1):1-10. [DOI:10.1023/B:BGEN.0000017682.96395.10] [PMID]
32.Sellier C, Boulanger E, Maladry F, Tessier FJ, Lorenzi R, Nevière R, et al. Acrylamide induces accelerated endothelial aging in a human cell model. Food and Chemical Toxicology. 2015; 83:140-5. [DOI:10.1016/j.fct.2015.05.021] [PMID]
33.Kim DB, Shin GH, Kim JM, Kim YH, Lee JH, Lee JS, et al. Antioxidant and anti-ageing activities of citrus-based juice mixture. Food Chemistry. 2016; 194:920-7. [DOI:10.1016/j.foodchem.2015.08.094] [PMID]
34.Cui H, Kong Y, Zhang H. Oxidative stress, mitochondrial dysfunction, and aging. Journal of Signal Transduction. 2012; 2012:646354. [DOI:10.1155/2012/646354] [PMID] [PMCID]
35.Liguori I, Russo G, Curcio F, Bulli G, Aran L, Della-Morte D, et al. Oxidative stress, aging, and diseases. Clinical Interventions in Aging. 2018; 13:757-72. [DOI:10.2147/CIA.S158513] [PMID] [PMCID]
36.Leutner S, Eckert A, Müller W. ROS generation, lipid peroxidation and antioxidant enzyme activities in the aging brain. Journal of Neural Transmission. 2001; 108(8-9):955-67. [DOI:10.1007/s007020170015] [PMID]
37.Elblehi SS, El Euony OI, El-Sayed YS. Apoptosis and astrogliosis perturbations and expression of regulatory inflammatory factors and neurotransmitters in acrylamide-induced neurotoxicity under ω3 fatty acids protection in rats. NeuroToxicology. 2020; 76:44-57. [DOI:10.1016/j.neuro.2019.10.004] [PMID]
38.Yang Y, Zhang L, Jiang G, Lei A, Yu Q, Xie J, et al. Evaluation of the protective effects of Ganoderma atrum polysaccharide on acrylamide-induced injury in small intestine tissue of rats. Food & Function. 2019; 10(9):5863-72. [DOI:10.1039/C9FO01452G] [PMID]
39.Sastre J, Pallardó FV, Viña J. Glutathione, oxidative stress and aging. Age. 1996; 19(4):129-39. [DOI:10.1007/BF02434082]
40.Sohal RS, Weindruch R. Oxidative stress, caloric restriction, and aging. Science. 1996; 273(5271):59-63. [DOI:10.1126/science.273.5271.59] [PMID]
41.Cudkowicz M, Sexton P, Ellis T, Hayden D, Gwilt P, Whalen J, et al. The pharmacokinetics and pharmacodynamics of procysteine in amyotrophic lateral sclerosis. Neurology. 1999; 52(7):1492-4. [DOI:10.1212/WNL.52.7.1492] [PMID]
42.Zamani E, Shokrzadeh M, Ziar A, Abedian-Kenari S, Shaki F. Acrylamide attenuated immune tissues’ function via induction of apoptosis and oxidative stress: Protection by L-carnitine. Human & Experimental Toxicology. 2018; 37(8):859-69. [DOI:10.1177/0960327117741753] [PMID]
43.Manouchehrabadi M, Farhadi M, Azizi Z, Torkaman-Boutorabi A. Carvacrol protects against 6-hydroxydopamine-induced neurotoxicity in in vivo and in vitro models of Parkinson’s disease. Neurotoxicity Research. 2020; 37(1):156-70. [DOI:10.1007/s12640-019-00088-w] [PMID]
44.Yang J, Guo J, Yuan J. In vitro antioxidant properties of rutin. LWT-Food Science and Technology. 2008; 41(6):1060-6. [DOI:10.1016/j.lwt.2007.06.010]
مقاله مروری: پژوهشي | موضوع مقاله: تخصصي
دریافت: 1400/6/15 | پذیرش: 1400/9/24 | انتشار: 1400/10/11

ارسال نظر درباره این مقاله : نام کاربری یا پست الکترونیک شما:
CAPTCHA

بازنشر اطلاعات
Creative Commons License این مقاله تحت شرایط Creative Commons Attribution-NonCommercial 4.0 International License قابل بازنشر است.

کلیه حقوق این وب سایت متعلق به مجله دانشگاه علوم پزشکی گیلان می باشد.

طراحی و برنامه نویسی : یکتاوب افزار شرق

© 2024 CC BY-NC 4.0 | Journal of Guilan University of Medical Sciences

Designed & Developed by : Yektaweb