مقدمه
در حال حاضر، جمعیت سالمندی رو به افزایش است [
1]؛ صنعتی شدن جوامع بشری، کاهش میزان فعالیت بدنی و تغییر سبک زندگی موجب بروز بیماریهایی در اقشار مختلف جامعه بهویژه در سالمندان شده است. گزارشها نشان میدهند سیروز کبدی رتبه پانزدهم بیماریهای جهان و یازدهمین علت مرگومیر در جهان را به خود اختصاص داده است. با اینکه روند مرگومیر بر اثر بیماریهای کبدی در سالمندان رو به کاهش است، اما هنوز سالمندان زیادی بر اثر ابتلا به این بیماریها جان خود را از دست میدهند [
2].
افزایش سن موجب اختلال در تنفس میتوکندریایی، کاهش ذخایر سلولهای بنیادی و کاهش سیستم ترمیم ژنی میشود که این اتفاقات موجب اختلال در نیمرخ چربی، متابولیسم قندها و پروتئینها و درنهایت، موجب کاهش توان حرکتی، آمادگی جسمانی و کارایی عضلات شده و درپی آن موجب افزایش خطر ابتلا به بیماریهای سندروم متابولیک، مانند بیماریهای کبدی میشود [
3،
4].
درواقع برهم خوردن تعادل اکسیدان/آنتیاکسیدانی در بدن متعاقب سالمندی و افزایش سطوح گونههای فعال اکسیژن/نیتروژن بهدنبال کاهش کارایی سیستم آنتیاکسیدانی آنزیمی و غیرآنزیمی بهوجود میآید. سالمندی با کاهش توان ترمیم ژنی موجب کاهش توان سلول سالمند در رونویسی از ژنهای آنتیاکسیدانی میشود و اختلال در آنزیمهای متابولیکی زنجیره انتقال الکترون، اختلال در آنزیمهای گیرنده لیپوپروتئینی به بیشتر شدن نسبت استرس اکسیداتیو نسبت به آنتیاکسیدانها شده که این عوامل موجب شروع التهاب، آپوپتوز و درنهایت، ابتلا به بیماریهای کبدی میشود [
5].
از سویی، سازمانهای بهداشتی و پژوهشگران درپی ارائه بهترین راهکار برای پیشگیری یا درمان اختلالات ناشی از سالمندی هستند. ازاینرو، تمرینات ورزشی منظم و طولانی مدت بهعنوان روش مؤثری برای بهبود سلامت سالمندان معرفی شدهاست [
6]. بهعبارتی، تمرینات ورزشی با بهبود سوختوساز بدن، بهبود متابولیسم چربی و کربوهیدرات که بهدنبال نیاز بافت عضلانی به انرژی اتفاق میافتد، به سلامت افراد منجر میشود [
7].
همچنین فعالیتهای ورزشی با بهبود عوامل هماتولوژی، ردوکس سلولی به افزایش بیوژنز میتوکندریایی و عوامل رونویسی از ژنها در بافت کبد میشود [
8]. درنتیجه، افزایش کارایی میتوکندریایی موجب افزایش رونویسی از ژنهای آنتیاکسیدانی در سلول و میتوکندری میشوند [
9]. بااینحال، پژوهشگران نتایج ضد و نقیضی در ارتباط با اثر تمرینات ورزشی با شدتهای مختلف بر سازگاری آنتیاکسیدانی اشاره کردهاند. برای مثال، در مطالعهای گزارش شد اگرچه 8 هفته تمرینات هوازی با شدت 60 درصد سرعت دویدن در موشهای آزمایشگاهی دچار نقص ژنتیکی لپتین موجب بهبود نشانگرهای بیوژنز میتوکندریایی شد، اما اثر معناداری بر آنزیمهای آنتیاکسیدانی مانند سوپر اکسید دیسموتاز، کاتالاز و گلوتاتیون پراکسیداز در بافت کبد مشاهده نشد [
9].
همچنین 6 هفته تمرین هوازی با شدت 65 درصد حداکثر سرعت دویدن در موشهای صحرایی موجب بهبود آنزیمهای کبدی آسپارتات آمینوترانسفراز و آلانین آمینوترانسفراز شد [
6].در مطالعه دیگری 8 هفته آزمایش تناوبی شدید موجب افزایش سوپراکسید دیسموتاز و کاتالاز در بافت کبد موشهای صحرایی در معرض دوکسوروبیسین شد، اما اثر معناداری بر سطوح مالوندیآلدئید بهعنوان یک شاخص پراکسیداسیون لیپیدی نداشت [
10]. در مطالعه قبلی ما [
11] نیز نتایج نشان داد 6 هفته آزمایش تناوبی شنا اثر معناداری بر نشانگرهای آپوپتوزی در بافت کبد موشهای صحرایی سالمند نداشت.
باتوجهبه نتایج ضد و نقیض در مطالعات بهنظر میرسد هنوز بهطور کامل سازوکار سازگاری تمرینات تناوبی شدید که به طول دوره تمرین و شدت تمرین وابسته است، به خوبی شناخته نشده است.
آزمایشات تناوبی شدید احتمالاً بیش از تمرینات تداومی با شدتهای پایین تا متوسط میتوانند استرس اکسیداتیو را تحریک کنند. بهتازگی برای پیشگیری از بر هم خوردن تعادل استرس اکسیداتیو آنتیاکسیدانها استفاده از آنتیاکسیدانهای طبیعی و مواد تشکیلدهنده گیاهان دارویی پیشنهاد شده است [
12, 13]. از بین این مواد آنتیاکسیدانی، فیتواستروژن رزوراترول بهدلیل خاصیت آنتیاکسیدانی، ضدالتهابی و ضدآپوپتوزی برای بهبود متابولیسم چربیها و قندها در درمان بسیاری از بیماریها استفاده میشود [
14]. رزوراترول با افزایش متابولیسم چربیها، کاهنده لیپوپروتئینهای کم چگال، کلسترول و افزایش فعالسازی مسیرهای بیولوژیکی ازطریق فسفریلاسیون پروتئین کینازها، به افزایش رونویسی از پروتئینها، کاهش پروتئین واکنشگر و بهبود آنزیمهای آنتیاکسیدانی در کبد بیماران مبتلابه کبد چرب غیرالکلی میشود [
15].
در این راستا، گزارش شده است که رزوراترول موجب افزایش ظرفیت آنتیاکسیدانی تام، افزایش آنتیاکسیدانهای آنزیمی مانند سوپر اکسید دیسموتاز، گلوتاتیون پراکسیداز، کاتالاز و غیرآنزیمی مانند گلوتاتیون احیاء و همچنین بهبود عملکرد ویتامینهای C و D میشود [
14]، گزارش شده است که مصرف 10 هفته رزوراترول موجب کاهش عوامل التهابی، کاهش برخی نشانگرهای آپوپتوزی و بهبود آنتیاکسیدانها در بافت قلب موشهای صحرایی سالمند میشود [
16].
بررسیهای انجامشده درباره اثر تعاملی تمرینات ورزشی و مکملدهی رزوراترول بهعنوان ایدهای تازه و جالب مطرح شده است. در این زمینه، پژوهشگران به مطالعهای پرداختند که در آن استفاده از 4 روز، روزانه 480 میلیگرم رزوراترول و پس از آن یک جلسه تمرین شدید ورزشی با 80 درصد حداکثر اکسیژن مصرفی را بررسی کردند. نتایج این پژوهشگران نشان داد در گروه رزوراترول سطوح اینترلوکین-6 سرمی کاهش یافت، اما تغییر معناداری در آنتیاکسیدانهای سرمی در گروه مکمل و دارونما در مردان بالغ مشاهده نشد [
16].
همچنین در مطالعه قبلی ما [
11] اثر ضدآپوپتوزی تمرین همزمان با مصرف رزوراترول مطلوبتر از اثر ورزش بهتنهایی بود. بررسیها نشان میدهد درباره اثر تعاملی تمرین شدید و رزوراترول بر بیان ژنهای آنتیاکسیدانی بهویژه در کبد اطلاعات محدودی وجود دارد. همچنین توجه به استفاده از مزیت آنتیاکسیدانی رزوراترول برای خنثیسازی استرس اکسیداتیو ناشی از فعالیتهای ورزشی میتواند به ارائه راهکار مناسبی در اختلالات متابولیکی بهویژه اختلالات کبدی ختم شود و به بهبود سلامت این افراد کمک کند. ازاینرو، مطالعه حاضر با هدف بررسی اثر تعاملی آزمایش تناوبی شنا و رزوراترول بر بیان نشانگرهای آنتیاکسیدانی و شاخص پراکسیداسیون لیپیدی در بافت کبد موشهای صحرایی سالمند انجام شد.
روشها
نگهداری از حیوانات و گروهبندی
در این پژوهش تجربی 32 سر موش صحرایی نر سالمند (18 تا 20 ماهه) با وزن تقریبی 350 تا 370 گرم از مرکز تحقیقات علوم اعصاب دانشگاه علومپزشکی کرمان خریداری و به محل آزمایشگاه انتقال داده شد. یکهفته موشهای صحرایی جهت سازگاری با محیط جدید در آزمایشگاه نگهداری شدند. طی دوره تحقیق، موشهای صحرایی در شرایط استاندارد شامل دمای 22 تا 24 درجه سانتیگراد، رطوبت نسبی 55 درصد، چرخه روشنایی/تاریکی 12 ساعته، دسترسی آزاد به آب و غذا نگهداری شدند. در روز هشتم، موشهای صحرایی سالمند بهطور تصادفی در گروههای کنترل (فقط دریافت متیل سلولز)، رزوراترول، آزمایش تناوبی شنا و آزمایش تناوبی شنا+رزوراترول تقسیم شدند. گروه شم در طول دوره تحقیق تنها حلال بیاثر رزوراترول (براساس مطالعات پیشین) دریافت کردند.
تمرین تناوبی شنا
انجام تمرین در این تحقیق براساس پروتکل تمرین Terada انجام شد. بدین صورت که موشهای صحرایی 6 هفته، 3 جلسه و در هر جلسه 14 سِت 20 ثانیهای شنا کردند و بین سِتهای فعالیت، 10 ثانیه استراحت درنظر گرفته شد. جهت رعایت اصل اضافهبار در هفته اول وزنهای به موشهای صحرایی بسته شد که معادل 9 درصد از وزن آنها بود و هر هفته 1 درصد به وزن آن اضافه شد. همچنین در هفته آخر میزان وزنه اضافهشده به 15 درصد وزن بدن موشهای صحرایی رسید [
15].
مکملدهی رزوراترول
در مدت دوره تحقیق گروههای دریافت رزوراترول روزانه 100 میلیگرم بهازای یک کیلوگرم وزن از مکمل رزوراترول محلول در 1 درصد متیل سلولز را از طریق گاواژ دریافت کردند [
17].
نمونهبرداری
در پایان 48 ساعت پس از آخرین جلسه تمرینی و مصرف رزوراترول موشهای صحرایی در حالت 16 ساعت ناشتایی به وسیله ترکیب کتامین و زایلوزین (نسبت 3 به 1) بیهوش شدند.جهت اطمینان از بیهوشی کامل ابتدا با استفاده از آزمون فشار به دُم و پای موش استفاده شد و پس از اطمینان از بیهوشی کامل و شکافتن حفره شکمی، بافت کبد موشهای صحرایی به دقت استخراج شد و بلافاصله در تانک ازت غوطهور شد. همچنین پس از آن تا زمان انتقال به آزمایشگاه سلولیمولکولی در دمای 70- نگهداری شد.
روش اندازهگیری متغیرها
برای اندازهگیری سطوح بیان ژنی سوپر اکسید دیسموتاز و گلوتاتیون پراکسیداز و شاخص پراکسیداسیون لیپیدی مالوندیآلدئید ابتدا بافت کبد با استفاده از هاون و سانترفیوژ هموژن شد. در ادامه براساس دستورالعمل کیت ستونی استخراج RNA ، ساخت کشور هنگکنگ RNA استخراج شد. همچنین برای اطمینان از کیفیت RNA با استفاده از ژل آگارز الکتروفورز و با استفاده از خاصیت جذب نوری در طول موج 260 نانومتر با دستگاه پیکودراپ شرکت سیگما (ساخت ایالات متحده آمریکا) استفاده شد.
علاوهبراین، برای بررسی کیفیت RNA از فرمول (C(μg/μl)=A260×ε×d/1000) استفاده شد. پس از آن سنتز cDNA براساس دستورالعمل کیت فرمنتاز (K1621) استفاده شد. cDNA سنتزشده جهت انجام واکنش رونویسی معکوس از آنزیم RevertAid™M-MuLV Reverse transcriptase استفاده شد. برای انجام واکنش رونویسی معکوس و رونویسی از ژنهای سوپر اکسید دیسموتاز و گلوتاتیون پراکسیداز پرایمرها با نرمافزار Allele IDv نسخه 8/7 طراحی و برای بررسی اختصاصی بودن و کارایی پرایمرها از نرمافزار موجود در سایت مرکز ملی اطلاعات زیستفناوری اطمینان حاصل شد (
جدول شماره 1).
سپس برای بررسی بیان ژنی متغیرها نمونهها در دستگاه Real Time PCR با نام Step One ساخت کشور ایتالیا قرار داده شدند. پس از اتمام فعالیت دستگاه و مشاهده نمودارهای آستانه بیان، مبنیبر افزایش تعداد قطعه موردنظر و میزان نشر فلورسانس با محاسبه ΔΔCt میزان تغییر در بیان ژن موردنظر نسبت به ژن کنترل داخلی و گروه کنترل با
فرمول شماره 1 محاسبه شد.
1. 2-tCΔΔ
جهت کمّیسازی متغیرها از
فرمول شماره 1 استفاده شد. همچنین برای اندازهگیری سطوح مالوندیآلدئید از روش ساندویچ الایزا و با استفاده از کیت ویژه اندازهگیری مالوندیآلدئید ساخت شرکت تجاری ZellBio با کد اقتصادی CAT No. ZB-MDA-96A با حساسیت 0/1µM استفاده شد.
روش تجزیهوتحلیل دادهها
در مطالعه حاضر، مقادیر متغیرهای کمّی بهصورت میانگین±انحرافمعیار نشان داده شد. جهت بررسی نرمال بودن توزیع دادهها از آزمون شاپیرو ویلک استفاده شد. بهمنظور مقایسه میانگین متغیرهای بررسیشده بین گروههای تحقیق از تحلیل واریانس یکطرفه (و آزمون تعقیبی توکی) استفاده شد. دادهها با نرمافزار SPSS نسخه 22 تجزیه و تحلیل شد و سطح معناداری 0/05 درنظر گرفته شد.
یافتهها
Wتفاوت معناداری در مقادیر سوپر اکسید دیسموتاز در گروههای تحقیق وجود نداشت (0/92=P) (
تصویر شماره 2).
بااینحال، این تغییرات به میزان بیان پروتئینهای وابسته به ردوکس سلولی مانند سیرتوئین 1، 3، P53 و عامل هستهای کاپا-بی وابستگی دارد؛ بهگونهای که اثر آزمایش تناوبی با شدت بالا متعاقب 8 هفته آزمایش تناوبی مطلوبتر از تمرین تداومی بود [
18]. ازاینرو، به نظر میرسد تمرینهای با شدت بالاتر اگرچه در نوع حاد و با شدتهای بالا موجب افزایش استرس اکسیداتیو میشود، اما پس از سازگاری میتوانند اثر مطلوبتری در فعالسازی مسیرهای PGC1-α و همچنین سیرتوئینها در افزایش رونویسی از پروتئینها و آنزیمهای آنتیاکسیدانی داشته باشند [
19].
همچنین پژوهشگران نشان دادهاند بهدنبال انجام تمرینات ورزشی، مسیرهای متفاوتی موجب سازگاریهای آنتیاکسیدانی میشوند.تمرینات ورزشی هم موجب افزایش حجم عضله، افزایش ظرفیت میتوکندریایی، افزایش فعالیت آنزیمهای زنجیره انتقال الکترون، افزایش لیپولیز شده و موجب افزایش توان سلول در تأمین انرژی میشود [
19].
همسو با مطالعه حاضر گزارش شد 6 هفته تمرینات تناوبی با شدت بالا و مقاومتی بر افزایش سوپر اکسید دیسموتاز و گلوتاتیون پراکسیداز اثر معناداری نداشت، اما تمرینات تناوبی با شدت بالا موجب افزایش ظرفیت آنتیاکسیدانی تام و مالوندیآلدئید در مقایسه با گروه تمرین مقاومتی و کنترل شد [
20]. بهنظر میرسد تفاوت در شدت تمرین با میزان افزایش گونههای فعال اکسیژن ارتباط دارد. همین امر در شرایط مطلوب با افزایش ظرفیت آنتیاکسیدانی میتواند در فعالسازی و برقراری ردوکس مؤثر باشد. تمرینات الاستیک مقاومتی موجب افزایش ظرفیت آنتیاکسیدانی تام، سوپر اکسید دیسموتاز و کاهش مالوندیآلدئید شد. بااینحال، تفاوت معناداری در مقادیر گلوتاتیون پراکسیداز مشاهده نشد [
21].
در مطالعهای دیگر گزارش شد 6 هفته تمرینات تناوبی با شدت بالا موجب افزایش مالوندیآلدئید، سوپر اکسید دیسموتاز و گلوتاتیون شد [
22]. بنابراین به نظر میرسد تمرینات شدید موجب افزایش رادیکالهای آزاد و درنتیجه افزایش پراکسیداسیون لیپیدی میشوند، اما همزمان با مسیرهای رونویسی هستهای بیان آنتیاکسیدانهای آنزیمی را بهبود میبخشند. بررسی مطالعات نشان میدهند تمرینات استقامتی (تداومی و تناوبی) وابسته به نوع، شدت و تعداد تمرین در هفته در سنین مختلف میتواند اثرات گوناگونی بر استرس اکسیداتیو داشته باشد. بااینحال، انجام انواع این تمرینات بهویژه در تمرینات با شدت بالا مشاهده شده است که ظرفیت آنتیاکسیدانی، سیستم دفاع آنتیاکسیدانی آنزیمی و غیرآنزیمی نیز بهبود مییابد.
نتایج نشان داد مکملدهی رزوراترول موجب افزایش مقادیر بیان ژنی گلوتاتیون پراکسیداز و کاهش مقادیر مالوندیآلدئید در بافت کبد موشهای صحرایی سالمند شد. بااینحال، اثر معناداری بر مقادیر بیان ژنی سوپر اکسید دیسموتاز نداشت. رزوراترول، آنتیاکسیدان طبیعی است که بهدلیل ماهیت عملکرد سلولی مولکولی خود موجب فعالسازی مسیر AMPK میشود و با فعال کردن SIRT1 در رونویسی از ژنهای آنتیاکسیدانی اثرگذار است. علاوهبراین، مسیر نیتریک اکسید نیز متعاقب مصرف رزوراترول میتواند به افزایش فعالسازی آنژیوژنز، افزایش متابولیسم چربیها، بهبود نیمرخ چربی، کاهش نشانگرهای آترواسکلروزیس، بهبود آنزیمهای کبدی، کاهش عوامل التهابی و درنهایت، افزایش بیان آنتیاکسیدانها و کاهش پراکسیداسیون لیپیدی شود [
23].
مصرف رزوراترول موجب مهار بیان عوامل اصلی التهابی، INF-γ، TNF-α، PC و مالوندیآلدئید میشود. همچنین رزوراترول میتواند موجب بهبود نیتریک اکسید و هم اکسیژناز-1 در بافت قلب موشهای صحرایی سالمند شود [
16] همچنین مصرف رزوراترول موجب افزایش پاراکسوناز، ظرفیت آنتیاکسیدانی تام، APOA ،HDL و کاهش HbA1c و گلوتاتیون ردوکتاز بیماران دیابتی نوع 2 شد [
24]. در مطالعهای دیگر، مصرف رزوراترول موجب کاهش ALT و نشانگر التهابی hs-CRP و کاهش درصد استئاتوز در بیماران مبتلابه کبد چرب شد [
25].
باتوجهبه مطالعات انجامشده مصرف رزوراترول با سازوکارهای متفاوتی به بهبود عملکرد کبد و کاهش استرس اکسیداتیو تأثیر دارد. علاوهبراین، بررسیها نشان میدهند رزوراترول علاوهبر سیستم دفاع آنتیاکسیدانی آنزیمی، سیستم آنتیاکسیدانی غیرآنزیمی را هم به خاطر فلاونوئیدها و مواد تشکیلدهنده خود بهبود میبخشد.
همچنین نتایج نشان داد آزمایش تناوبی شنا و مکملدهی رزوراترول بهطور همزمان موجب افزایش بیان ژنی گلوتاتیون پراکسیداز و کاهش مالوندیآلدئید در بافت کبد موشهای صحرایی سالمند شد. باتوجهبه بررسیهای انجامشده به نظر میرسد تمرینات تناوبی با شدت بالا در این مطالعه با سازوکار فعالسازی آدنیلات سیکلاز، افزایش آدنوزین مونوفسفات حلقوی، NRF1/2 AMPK و PGC1α موجب افزایش بیان آنزیمهای آنتیاکسیدانی در میتوکندری و DNA سلول در بافت کبد میشوند [
18،
26].
همچنین رزوراترول با سازوکار AMPK ، SIRT1 موجب افزایش فعالسازی آنژیوژنز، بهبود نشانگرهای متابولیکی و بهبود آنزیمهای کبدی موجب افزایش بیان آنتیاکسیدانها در کبد میشود [
23] که میتواند با افزایش دفاع آنتیاکسیدانی از عوارض کبدی بکاهد. اگرچه افزایش استرس اکسیداتیو متعاقب فعالیت ورزشی شدید در سالمندی امری اجتنابناپذیر است، اما سالمندان جهت استفاده از مزایای تمرین ناگزیر به انجام آن هستند، درحالیکه مصرف رزوراترول میتواند موجب مهار رادیکالهای آزاد ناشی از تمرینات تناوبی با شدت بالا شود.
در این زمینه، مطالعه مهری و همکاران نشان داد تمرین هوازی و مکمل رزوراترول هرکدام به تنهایی توانستند از افزایش شاخصهای آپوپتوزی در بافت قلب موشهای صحرایی دیابتیشده با استروپتوزتوسین جلوگیری کنند، اما اثر تعاملی این 2 آزمایش بر برخی از این پروتئینها معنادار نبود [
27].
همچنین مصرف همزمان رزوراترول و تمرینات تناوبی با شدت بالا موجب بهبود مولکولهای چسبان بین سلولی-1 و پروتئین جاذب شیمیایی مونوسیت در موشهای صحرایی شد و اثر تعاملی تمرین و مکمل به مراتب مطلوبتر از هرکدام به تنهایی بود. بهنظر میرسد باید مسیرهای متنوعی درباره اثر تعاملی ارزیابی شود. باتوجهبه نقش پروتئینهای مسئول رونویسی وابسته به پیامبرهای سلولی بهنظر میرسد عدم اندازهگیری کلسیم کالمودولین، cAMP و دیگر سازوکارها مانند SIRT1 و PGC1- α از محدودیتهای این مطالعه باشد.
ازاینرو، ارزیابی این متغیرها در مطالعات آتی پیشنهاد میشود. همچنین باتوجهبه گستردگی سیستم دفاع آنتیاکسیدانی، عدم اندازهگیری نشانگرهای آنتیاکسیدانی غیرآنزیمی نیز در این مطالعه از محدودیتهای دیگر است. ازاینرو پیشنهاد میشود در مطالعات آتی ارزیابی گستردهتری از سیستم آنتیاکسیدانی بهعمل آید.
بهنظر میرسد تمرینات شنای تناوبی و رزوراترول هرکدام بهتنهایی اثرات مطلوبی بر بهبود سیستم دفاع آنتیاکسیدانی و کاهش پراکسیداسیون لیپیدی در بافت کبد متعاقب سالمندی دارد. بااینحال، تعامل این 2 آزمایش در سالمندی وابسته به سازوکارهای متفاوتی مانند فعالسازی رونویسی سلولی و فعالیت آنتیاکسیدانی غیرآنزیمی است. باتوجهبه نتایج تحقیق حاضر، پیشنهاد تجویز همزمان تمرین و مکملدهی رزوراترول نیاز به بررسیهای بیشتری دارد.
ملاحظات اخلاقی
پیروی از اصول اخلاق پژوهش
این مقاله با شناسه IR.IAU.M.REC.1399.036 در کمیته اخلاق دانشگاه آزاد اسلامی واحد مرودشت تأیید شده است
حامی مالی
این پژوهش برگرفته از پایاننامه دکتری مریم مهبودی رشته تربیت بدنی گرایش فیزیولوژی ورزشی، دانشکده تربیت بدنی دانشگاه آزاد اسلامی واحد علیآباد کتول است. این تحقیق هیچ کمک مالی خاصی از هیچ سازمان تأمین مالی در بخشهای عمومی، تجاری یا غیرانتفاعی دریافت نکرد.
مشارکت نویسندگان
تمام نویسندگان در طراحی، اجرا و نگارش همه بخشهای پژوهش حاضر مشارکت داشتند.
تعارض منافع
بنابر اظهار نویسندگان، این مقاله تعارض منافع ندارد.
تشکر و قدردانی
نویسندگان از معاونت پژوهشی دانشگاه آزاد اسلامی واحد علیآباد کتول تقدیر و تشکر میکنند.