مقدمه
بعد از جداسازی گیرندههای اوپیوئیدی، لیگاندهای اوپیوئیدهای آندروژن شناسایی شدند. گروهی از این لیگاندها به نام انکفالین و گروهی دیگر بتا آندروفین هستند [
1]. ترکیبات اوپیوئیدی اثرات فارماکولوژیکی خود را از طریق فعال کردن گیرندههای اوپیوئیدی اعمال میکنند [
2]. مورفین به عنوان آگونیست گیرنده µ، مهمترین آلکالوئید تریاک در نظر گرفته میشود و تاکنون خواص فارماکولوژیکی زیادی در مورد مورفین در خصوص اثرات ضددردی، کاهش حافظه و یادگیری و اضطراب معرفی شده است [
3]. مورفین با اثر روی گیرندهها µ باعث مهار آزادسازی نوروترانسمیترهای مختلفی مثل نورآدرنالین، استیل کولین و نوروپپتید P میشود [
4]. استیل کولین یک نوروترانسمیتر است که در گانگلیونهای اتونومیک و عقدههای قاعدهای نیز یافت میشود. اندازهگیری غلظتهای آنزیمهای استیل کولین ترانسفراز و استیلکولین استراز که به ترتیب در سنتز و تجزیه استیلکولین درگیر هستند، نشان میدهد که مهار فعالیت استیلکولین استراز میتواند کاهش استیل کولین را جبران کند [
5].
استرس اکسیداتیو اختلال در تعادل اکسیدان آنتیاکسیدان است. بیشتر سلولها درجه خفیفی از استرس اکسیداتیو را تحمل میکنند، چون دارای ظرفیت دفاع آنتیاکسیدانی کافی هستند. عدم تعادل اکسیدان آنتیاکسیدان و اختلال در تولید و توزیع گونههای واکنشی اکسیژن و یا بیش از حد بودن آنها نسبت به سایر فاکتورها سبب نبودن ظرفیت آنتیاکسیدانی میشود. سیستمهای زیستی دارای مکانیسم دفاعی درونی هستند که به محافظت در برابر آسیبهای سلولی حاصل از رادیکالهای آزاد کمک میکند [
6]. گلوتاتیون پراکسیداز، کاتالاز و سوپراکسید دیسموتاز آنزیمهای آنتیاکسیدانی اصلی درگیر در دفاع و حذف رادیکالهای اکسیژن فعال هستند. این آنزیمها به کوفاکتورهایی مثل آهن، مس، روی و منگنز برای فعالیت کاتالیتیک بهینه و مکانیسم دفاعی مؤثر نیاز دارند [
7].
در دهههای اخیر استفاده از مکملهای گیاهی و گیاهان دارویی (به علت دارا بودن ترکیبات فیتوشیمیایی) برای درمان بیماریها به شدت افزایش یافته است. یکی از مهمترین حوزههای طب سنتی در سراسر جهان حوزه مربوط به گیاه درمانی است و عصارههای تهیهشده از گیاهان برای تعیین یک منبع درمانی آزمایش میشوند. عناب با نام علمی Ziziphus jujuba گیاهی درختی با خواص دارویی است که ارتفاع آن به 10 متر نیز میرسد و متعلق به تیره عنابیان است. میوه زیتونی شکل عناب در ابتدا سبز بوده و پس از رسیدن به رنگ قرمز درآمده و چروک میخورد. عناب را خرمای قرمز و خرمای چینی نیز مینامند که در نواحی با درجه حرارت پایین پراکنده شده و در آسیا، برزیل و نپال یافت میشود [
8].
عناب از گیاهان بومی فلات ایران است و در مناطق وسیعی از ایران کشت میشود. میوه عناب دارای ویتامینهای A ،C و E و ترکیباتی مانند ساپونینها، الکالوئیدها، فلاونوئیدها، تری ترپنوئید، جوجوبا، مشتقات اسید بتولینیک است. قرارگیری این ترکیبات در کنار هم موجب ایجاد اثرات همافزایی در فعالیت آنتیاکسیدانی آن میشود [
9, 10, 11]، بنابراین در طی دوران تکامل، سیستمهای بیولوژیکی با طراحی و ساخت آنتیاکسیدانها، جانداران را در مقابل اثرات زیانبار رادیکالهای آزاد محافظت کردهاند. سیستم دفاع آنتیاکسیدانی، شامل عوامل آنزیمی نظیر SOD، CAT و GPx و عوامل غیرآنزیمی نظیر ویتامین E، ویتامین C، کاروتنوئیدها، پلیفنلها و مولکولهای دیگر است که به عنوان آنتیاکسیدان در خنثیسازی بسیاری از رادیکالهای آزاد وگونههای فعال اکسیژن دخالت دارند [
12]. مطالعات نشان داد عصاره میوه عناب باعث افزایش فعالیت آنزیمهای SOD و GPx در موشهای تیمارشده با اتانول در مغز [
13] و افزایش فعالیت آنزیمهای CAT و SOD در موشهای تیمارشده با ایبوپروفن میشود [
14].
اعتیاد به مورفین و سایر اوپیاتها یکی از مشکلات مهم جوامع امروزی است. بنابراین شناسایی و یافتن داروهای گیاهی مؤثر با نقش محافظتی از اهمیت زیادی برخوردار است. این پژوهش به منظور بررسی اثرات محافظتی عصاره عناب و تعیین اثرات آنتیاکسیدانی عصاره اتانولی میوه عناب بر روی فعالیت آنزیمهای SOD، CAT و استیل کولین استراز بخش کورتکس مغز و سرم موش صحرایی نر تیمارشده با مورفین انجام شد.
مواد و روشها
حیوانات: این پژوهش در آزمایشگاه فیزیولوژی جانوری گروه زیستشناسی دانشگاه مازندران در سال 1396 انجام شد. در این مطالعه تجربی 42 سر موش صحرایی نر نژاد ویستار در محدوده وزنی 200-250 گرم از پژوهشکده انستیتو پاستور آمل خریداری شدند و در اتاق حیوانات دانشکده زیستشناسی در شرایط استاندارد 12 ساعت نور و 12 ساعت تاریکی، رطوبت 50-40 درصد و دمای 25 درجه سانتیگراد نگهداری شدند. آب و غذای مخصوص حیوانات به میزان کافی در دسترس آنها قرار گرفت. برای سازگاری جانوران با محیط، آزمایشها یک هفته بعد از انتقال موشها به آزمایشگاه انجام گرفت.
تهیه عصاره گیاهی اتانولی: در این تحقیق، میوه درخت عناب در اواخر آبان ماه سال 1396 (از منطقه شهرستان درگز، استان خراسان رضوی، ایران) جمعآوری شد و توسط گروه سیستماتیک گیاهی دانشکده علوم پایه دانشگاه مازندران تأیید شد. سپس میوهها (دانه و پالپ) را دور از نور خورشید و در سایه خشک کرده و به وسیله آسیاب الکتریکی (Moulinex, model AR1066Q) به پودر تبدیل شد. سپس مقدار 100 گرم از پودر گیاه در ظرف مخصوص ریخته شده و 500 میلیلیتر اتانول به آن اضافه شد و به مدت 4 روز در دستگاه تکاندهنده (شیکر) (IRK، آمریکا) قرار داده شد و سپس عمل صاف کردن با کاغذ صافی طی دو مرحله انجام گرفت. عصاره خالص به دست آمده به وسیله دستگاه تبخیرکن چرخان Heidolph) ، Laborota 4000، آلمان) حلالپرانی و غلیظ شد [
15]. عصاره خالص اتانولی بهدستآمده تا زمان استفاده در فریزر20- درجه سانتیگراد (ElectroSteel ،ES35، ایران) نگهداری شد.
طراحی و گروهبندی: در این تحقیق حیوانات به شش گروه هفتتایی تقسیم شدند. گروههای مورد مطالعه شامل: گروه کنترل، نرمال سالین را به صورت درونصفاقی و به صورت گاواژ دریافت کردند. گروه آزمایش مورفین، نرمال سالین را به صورت گاواژ و 30 دقیقه بعد مورفین (0/5 میلیگرم بر کیلوگرم) را به صورت درونصفاقی دریافت کردند [
15]. گروه آزمایش عصاره 100، دُز 100 میلیگرم بر کیلوگرم وزن بدن عصاره میوه گیاه عناب را به صورت گاواژ و 30 دقیقه بعد نرمال سالین را به صورت درونصفاقی دریافت کردند [
16]. گروه آزمایش عصاره 200، دُز 200 میلیگرم بر کیلوگرم وزن بدن عصاره میوه گیاه عناب را به صورت گاواژ و 30 دقیقه بعد نرمال سالین را به صورت درونصفاقی دریافت کردند، گروه آزمایش عصاره 100 به علاوه مورفین، دُز 100 میلیگرم بر کیلوگرم وزن بدن عصاره میوه گیاه عناب را به صورت گاواژ و 30 دقیقه بعد مورفین را به صورت درونصفاقی دریافت کردند. گروه آزمایش عصاره 200 به علاوه مورفین، دُز200 میلیگرم بر کیلوگرم وزن بدن عصاره میوه گیاه عناب را به صورت گاواژ و 30 دقیقه بعد مورفین را به صورت درونصفاقی دریافت کردند. تمام تیمارها به مدت 30 روز و در ساعت 8 الی 10 صبح انجام شدند. آخرین گاواژ برای هر موش صحرایی 24 ساعت قبل از بیهوشی بود. در پایان دوره زمانی تیمارها (روز 31) خونگیری و نمونهبرداری انجام شد و برای سنجش آنزیمی مورد استفاده قرار گرفت.
نحوه خونگیری و هموژن کردن بافت
برای تهیه نمونه آزمایش، پس از آخرین تزریق با رعایت شرایط ناشتا، حیوان را در ظرف شیشهای مخصوص دیسیکاتور با کلروفرم بیهوش کرده و سپس با خواباندن حیوان به پشت با نوک انگشتان محل قلب مشخص میشد و با سرنگهای 5 سیسی مستقیم از قلب حیوان خونگیری انجام شد. برای جداسازی سرم، نمونه خون به مدت 10 دقیقه با سرعت g× 3000 سانتریفیوژ (Sigma 3-30 Ks، آلمان) شد. بعد از جداسازی سرم خون از لخته به وسیله سمپلر، نمونهها برای سنجش آنزیمAChE، CAT و SOD در فریزر نگهداری شدند. برای هموژنسازی بافت کورتکس مغز، ابتدا موش صحرایی با کلروفرم بیهوش شده و سپس جمجمه شکافته شد و قسمت کورتکس مطابق با اطلس پاکسینوس و واتسون جدا شد. نمونهها در تانک نیتروژن مایع قرار داده شد، سپس بافتها از تانک خارج و به هاون چینی انتقال داده شد، به طوری که با فاصله زمانی، چندین بار ازت مایع روی بافت ریخته شد تا بافت سفت و شکننده باقی بماند و همزمان بافت را کوبیده، به طوری که بافت کاملاً خرد و به شکل پودر شد. بعد از تعیین وزن بافت هموژنشده آن را به لوله فالکون انتقال داده و به ازای هر گرم از بافت 10 میلیلیتر بافر فسفات سدیم 100 میلیمولار با pH=4/7 اضافه شد. سپس به مدت 20 دقیقه با سرعت g×10000 در دمای 4 درجه سانتیگراد سانتریفیوژ شد و درنهایت مایع شفاف رویی برای سنجش آنزیم CAT، SOD و AChE جداسازی شد و تا زمان انجام آزمایش نمونهها در فریزر نگهداری شدند [
16].
سنجش فعالیت پارامترهای بیوشیمی
تعیین فعالیت کاتالاز
اندازهگیری فعالیت آنزیم CAT با استفاده از سوبسترای پراکسید هیدروژن انجام شد. واکنش در کوت 3 میلیلیتری انجام گرفت. حجم مخلوط واکنش شامل 980 میکرولیتر محلول 30 میلیمولار آب اکسیژنه و 2 میلیلیتر بافر سدیم فسفات 50 میلیمولاربا pH=7 و 20 میکرولیتر از نمونه سرم است. واکنش با افزودن سوبسترا شروع و تغییرات جذب در طول مدت 2 دقیقه در طول موج 240 نانومتر اندازهگیری شد. فعالیت آنزیم کاتالاز با استفاده از ضریب خاموشی M-1CM-1 4 /39 براساس قانون بیرلامبرت (A=ɛdc) محاسبه و به صورت U/ml برای سرم و U/g tissue برای بافتها گزارش شد. بر طبق تعریف، یک واحد CAT مقدار آنزیمی است که موجب تجزیه یک میکرومول H2O2 در مدت یک دقیقه در دمای 25 درجه سانتیگراد شود [
17].
تعیین فعالیت انزیم سوپراکسید دیسموتاز (SOD)
برای سنجش فعالیت آنزیم SOD از روش اتواکسیداسیون پیروگالل استفاده شد. بدینمنظور از بافرتریس هیدروکلرید 50 میلیمولار با pH=2/8 و اتیلن دیآمین تترا استیک اسید (EDTA) یک میلیمولار و پیرو گالول 0/2 میلیمولار استفاده شد. 2900 میکرولیتر لیتراز بافر تریس هیدروکلرید حاوی EDTA و با 50 میکرولیتر محلول رویی مخلوط و سپس 50 میکرولیتر محلول پیروگالل به محلول فوق اضافه شده و تغییرات جذب طی 5 دقیقه با فاصله 30 ثانیه در طول موج 420 نانومتر خوانده شد. برای اندازهگیری اتواکسیداسیون پیرو گالل به تنهایی به عنوان شاهد به جای سوپر ناتانت 50 میکرولیتر آب مقطر اضافه شد و به ترتیب فوق جذب در طول موج 420 نانومتر خوانده شد و درصد مهار اتو اکسیداسیون پیروگالل از
فرمول شماره 1 محاسبه شد [
18].
1.
درصد مهار پیروگالل = (dA/dt_blank - dA/dt_sample) / dA/dt_blank ×100
dA/dt_blank= تغییرات جذب در واحد زمان (بلانک)
dA/dt_sample= تغییرات جذب در واحد زمان (نمونه)
تعیین فعالیت آنزیم استیل کولین استراز (AChE)
برای سنجش فعالیت آنزیم AChE، با اندازهگیری سرعت تولید تیوکولین به منزله محصول کاتالیز آنزیمی به روی استیل تیوکولین به عنوان سوبسترا انجام شد. تیوکولین به محض تولید با 5 دی تیو بیس 2 نیتروبنزوئیک اسید واکنش میدهد تا آنیون زرد رنگ ایجاد شود. 10 میکرولیتر از نمونه آنزیم و 2950 میکرولیتر از بافر سدیم فسفات 50 میلیمولار pH=5/7 به 20 میکرولیتر از معرف DTNB 10میلیمولار و 20 میکرولیتر استیل تیوکولین یداید با غلظت 75 میلیمولار به عنوان سوبسترا اضافه شد. پس از افزودن سوبسترا، سرعت تولید تیوکولین با پیگیری واکنش آن با DTNB و تولید آنیون زردرنگ 2 نیترو 5 مرکاپتو بنزوئیک اسید در طول موج 412 نانومتر اندازهگیری شد. تغییرات جذب بر حسب زمان (دقیقه) توسط دستگاه اسپکتروفتومتر (Biotek Epoch, USA) به مدت 5 دقیقه در هر 30 ثانیه یکبار خوانش و ثبت شد. روش سنجش نمونه شاهد نیز همانند نمونه دارای آنزیم است. تنها تفاوت اینکه نمونه شاهد فاقد آنزیم بوده و به جای آنزیم از بافر استفاده شد. فعالیت آنزیم بر اساس میکرومول بر دقیقه در هر میلیلیتر و میکرومول بر دقیقه در هر گرم بافت کورتکس (μmol/min/g) گزارش شد [
19].
تجزیه و تحلیل آنالیز آماری
نتایج به صورت انحراف معیار±میانگین برای نمونههای موجود در هر گروه بیان شد. برای بررسی فرض برابری واریانسها از آزمون لون استفاده شد. پس از تعیین طبیعی بودن توزیع دادهها و برقراری فرض برابری واریانسها، برای تجزیه و تحلیل آماری دادهها و مقایسه بینگروهی از آنالیز واریانس یکطرفه و به دنبال آن از آزمون تعقیبی Tukey با سطح معنیداری 05/P<0 استفاده شد. تمام محاسبات آماری با استفاده از نرمافزار آماریSPSS نسخه 21 انجام شد.
نتایج
نتایج فعالیت آنزیم استیل کولین استراز در سرم و کورتکس
نتایج حاصل از این تحقیق با استفاده از آنالیز واریانس ANOVA نشان داد در گروههای مورد مطالعه تغییرات معنیداری در فعالیت آنزیم AChE سرم و کورتکس مشاهده شد (P>0/001). همان طور که در
جدول شماره 1 مشاهده میشود، فعالیت آنزیم AChE سرم در گروه آزمایش مورفین نسبت به گروه کنترل کاهش معنیداری داشت (P>0/001).
![](./files/site1/images/%D8%AC1(8).jpg)
تزریق عصاره 100 و 200 میلیگرم بر کیلوگرم به گروه مورفین باعث افزایش فعالیت آنزیم AChE نسبت به گروه مورفین شد اما این تغییرات معنیدار نبود، در صورتی که دُزهای 100 (0/004=P) و 200 میلیگرم بر کیلوگرم (0/036=P) نسبت به گروه کنترل به ترتیب تغییرات معنیداری را نشان دادند. گروههایی که عصاره 100 و 200 میلیگرم بر کیلوگرم را بهتنهایی دریافت کردند، به ترتیب تغییرات معنیداری در سطح (0/015=P) و (0/004=P) نسبت به گروه مورفین نشان دادند. در سایر گروهها تفاوت معنیداری مشاهده نشد. همان طور که در
جدول شماره 1 مشاهده میشود فعالیت آنزیم AChE کورتکس در گروه مورفین (0/61±7/02) نسبت به گروه کنترل (13/56±0/73) کاهش معنیداری نشان داد (P>0/001). تزریق عصاره 100 و 200 میلیگرم بر کیلوگرم به گروه مورفین باعث افزایش فعالیت آنزیم AChE نسبت به گروه مورفین شد، به طوری که در غلظت 100 میلیگرم بر کیلوگرم تغییرات معنیداری مشاهده نشد اما در غلظت 200 میلیگرم بر کیلوگرم تغییرات معنیداری مشاهده شد (0/002=P). گروههایی که عصاره 100 و 200 میلیگرم بر کیلوگرم را بهتنهایی دریافت کردند، تغییرات معنیداری نسبت به گروه آزمایش مورفین نشان دادند (0/001=P).
نتایج فعالیت آنزیم کاتالاز در سرم و کورتکس
نتایج حاصل از این تحقیق با استفاده از آنالیز آماری نشان داد در گروههای مورد مطالعه تغییراتی معنیداری در فعالیت آنزیم CAT سرم و کورتکس مشاهده شد (P>0/001). همان طور که در
جدول شماره 1 مشاهده میشود، فعالیت آنزیم CAT کورتکس در گروه مورفین (8/09±0/91) نسبت به گروه کنترل (20/79±1/31) کاهش معنیداری پیدا کرد (P>0/001). تزریق عصاره 100 و 200 میلیگرم بر کیلوگرم به گروه مورفین باعث افزایش غیرمعنیدار فعالیت آنزیم CAT نسبت به گروه مورفین شد (P<0/05)، در حالی که نسبت به گروه کنترل تغییرات معنیداری در سطح (0/005=P) و (0/027=P) مشاهده شد. گروههایی که عصاره 100 و 200 میلیگرم بر کیلوگرم را به تنهایی دریافت کردند، تغییرات معنیداری نسبت به مورفین نشان دادند (P>0/001). فعالیت آنزیم CAT سرم در گروه آزمایش مورفین نسبت به گروه کنترل کاهش معنیداری نشان داد (P>0/001). همچنین تزریق عصاره 100 و 200 میلیگرم بر کیلوگرم به تنهایی تفاوت معنیداری نسبت به گروه مورفین نشان داد (P>0/001). با تزریق عصاره 100 (0/015=P) و 200 (0/017=P) میلیگرم بر کیلوگرم به گروه مورفین باعث افزایش فعالیت آنزیم نسبت به گروه مورفین شد، اما این افزایش معنیدار نبود، در حالی که نسبت به گروه کنترل تفاوت معنیداری مشاهده شد (
جدول شماره 1).
نتایج فعالیت آنزیم سوپراکسید دیسموتاز در سرم و کورتکس
نتایج حاصل از این تحقیق با استفاده از آنالیز واریانس ANOVA نشان داد در گروههای مورد مطالعه تغییرات معنیداری در فعالیت آنزیم سوپراکسید دیسموتاز در سرم و کورتکس مشاهده شد (0/001=P). همان طور که در
جدول شماره 1 مشاهده میشود، فعالیت آنزیم SOD کورتکس در گروه مورفین در مقایسه با گروه کنترل کاهش معنیداری را نشان داد (0/001=P) در حالی که دیگر گروههای تیمار در مقایسه با گروه کنترل تغییرات معنیداری را نشان ندادند (P<0/05). تزریق عصاره میوه گیاه عناب در دو غلظت 100 و 200 میلیگرم بر کیلوگرم بهتنهایی فعالیت آنزیم SOD را نسبت به گروه مورفین افزایش داد (P>0/01). نتایج ما همچنین نشان داد گروههای آزمایش مورفین بعد از دریافت عصاره میوه گیاه عناب، میزان بازدارندگی آنزیم SOD را نسبت به گروه آزمایش مورفین افزایش دادند، به طوری که فقط در گروه آزمایش مورفین+عصاره 200 افزایش معنیداری در فعالیت آنزیم SOD مشاهده شد (0/013=P). فعالیت آنزیم SOD سرم در گروه مورفین نسبت به گروه کنترل کاهش معنیداری نشان داد (0/011=P). نتایج ما نشان داد تزریق عصاره میوه گیاه عناب در دو غلظت 100 و 200 میلیگرم بر کیلوگرم فعالیت آنزیم SOD را نسبت به گروه مورفین افزایش داد (P>00/05). با تزریق عصاره 100 و 200 به گروه مورفین فعالیت آنزیم نسبت به مورفین افزایش یافت اما تفاوت معنیداری مشاهده نشد. همچنین تفاوت معنیداری بین گروهها با گروه کنترل مشاهده نشد (
جدول شماره 1).
بحث و نتیجهگیری
این مطالعه به منظور تعیین اثر عصاره اتانولی میوه عناب بر میزان فعالیت آنزیمهای آنتیاکسیدان بافت کورتکس و سرم در موشهای صحرایی نر تیمارشده با مورفین صورت پذیرفت. روش استخراج با حلالهای مختلف در کمیت و کیفیت استخراج متابولیتهای ثانویه فنلی و فلاونوئیدها نقش به سزایی دارد، به طوری که مطالعات پیشین نشان دادند، حلالهای متانول و اتانول نسبت به حلال آبی با قدرت نفوذ بیشتر به داخل سلولهای گیاه داشته و ترکیبات طبیعی ثانویه شامل فنولها و فلاونوئیدهای بیشتری را استخراج میکند [
20]. قدرت مهارکنندگی رادیکالهای آزاد کاملاً وابسته به غلظت ترکیبات فنولی و فلاونوئیدها بوده و با افزایش آن بیشتر میشوند [
21]. بنابراین در پژوهش حاضر برای یافتن ترکیبات جدید با منشأ گیاهی و همچنین کیفیت استخراج بیشتر از حلال اتانول برای عصارهگیری میوه عناب استفاده شد.
در پژوهش حاضر مشخص شد که میزان فعالیت آنزیم کاتالاز و SOD در گروههای دریافتکننده مورفین کاهش یافته است که نشاندهنده افزایش استرس اکسیداتیو است. ایکسو و همکارانش نشان دادند که تزریق مزمن هروئین، ظرفیت کل آنزیمهای آنتیاکسیدانی مانند SOD ،CAT و GPx که سیستمهای آنتیاکسیدانی داخل سلولی بدن هستند را در سرم و مغز کاهش میدهند [
22]. التهاب نورونی و استرس اکسیداتیو همچنین کاهش ظرفیت آنتیاکسیدانی به دنبال مصرف مزمن اوپیوئیدها از جمله مکانیسمهای بروز تحمل و وابستگی اوپیوئیدی بوده و مهار هریک از موارد فوق نقش تعیینکنندهای در کاهش عوارض اوپیوئیدی دارند [
23,
24]. برای بهبود ظرفیت آنتیاکسیدانی طبیعی بدن، ترکیبات پلیفنلی موجود در عصاره میوه عناب با خواص آنتیاکسیدانی میتوانند نقش مهمی داشته باشند.
SOD یک متالوآنزیم مهم است که به عنوان نخستین خط دفاعی بدن علیه گونههای فعال اکسیژن عمل کرده و باعث حذف رادیکالهای سوپراکسید از طریق تبدیل آن به آب اکسیژنه میشود. SOD به شکل وسیعی در مغز توزیع شده و به طور پیوسته و یکنواخت در تمام عمر فعالیت میکند. از طرفی بررسی میزان شاخصهای آنتیاکسیدانی نشان داد که تزریق درونصفاقی مورفین به عنوان مادهای که سبب افزایش استرس اکسیداتیو به دلیل تشکیل فراوان آنیونهای سوپراکسید میشود، موجب کاهش معنیداری در فعالیت آنزیم کاتالاز، درصد بازدارندگی فعالیت آنزیم SOD و فعالیت آنزیم AChE شده است. به نظر میرسد که غیرفعال شدن SOD توسط آنیونهای افزایش یافته سوپراکسید منجر به غیرفعال شدن کاتالاز میشود. در این پژوهش گاواژ عصاره عناب موجب افزایش فعالیت آنزیمهای آنتیاکسیدانی شد که این امر ممکن است در اثر پاکسازی رادیکالهای آزاد توسط عصاره اتانولی عناب باشد. همسو با نتایج پژوهش حاضر، دلال و همکارانش تجویز خوراکی 500 میلیگرم بر کیلوگرم عصاره آبی میوه عناب به موشهای تیمارشده با ایبوپروفن را ارزیابی کرده و افزایش فعالیت SOD و CAT را مشاهده کردند [
14]. تاتی و همکارانش نشان دادند که تجویز خوراکی 200 میلیگرم بر کیلوگرم عصاره آبی میوه عناب به مدت 8 هفته باعث افزایش فعالیت آنزیم SOD در موشهای تیمارشده با اتانول در هیپوکمپ میشود؛ با این تفاوت که به جای مورفین از اتانول استفاده شد [
13]. CAT یک آنزیم آنتیاکسیدانی و سیتوزولی و با سطح پایین در میتوکندری است و برای پایین نگه داشتن سطح آباکسیژنه سلولی نقش حیاتی دارد. سطح این آنزیم در مناطقی از مغز که مستعد آسیبهای اکسیداتیو است، بالاست [
25]. بنابراین اعتقاد بر این است که سطح پایین CAT ممکن است منجر به برخی اثرات مخرب ناشی از رادیکالهای سوپراکسید و پراکسید هیدروژن و همچنین باعث آسیب سلولی شود.
تستهای بیوشیمیایی نشان داد عصاره عناب با دارا بودن خاصیت آنتیاکسیدانی و افزایش انتقالدهنده استیل کولین، سبب افزایش فعالیت AChE شد. همچنین با توجه به نتایج حاضر سطح فعالیت آنزیم AChE سرم و کورتکس بعد از تزریق مورفین در مقایسه با گروه کنترل کاهش یافت. مورفین با کاهش آزادسازی استیل کولین در فضای سیناپسی سبب کاهش فعالیت آنزیم AChE میشود. در واقع مصرف عصاره عناب باعث افزایش آزادسازی انتقالدهنده استیل کولین و افزایش فعالیت آنزیم AChE نسبت به گروه مورفین شد. مطالعات نشان داد که عصارههای آلکالوئیدهای Lycopodium clavatum و Lycopodium thyoides با دارا بودن خواص آنتیاکسیدانی باعث مهار آنزیم AChE دربافتهای قشر مغز، هیپوکامپ و استریاتوم موش صحرایی شد که با نتایج ما همخوانی ندارد؛ دلیل این مغایرت احتمالاً میتواند مربوط به گونه گیاهی و نوع عصاره (آلکالوئیدی)، مدت زمان، نوع تزریق (درونصفاقی) و غلظت عصاره (1، 10 و و 25 میلیگرم بر گیلوگرم) باشد [
26]. مصرف اتانول مزمن و حاد منجر به کاهش قابل توجه آنزیمهای آنتیاکسیدان، افزایش پراکسیداسیون لیپید و افزایش فعالیت آنزیم AChE در کل مغز و یا درهیپوکامپ میشود [
27, 28, 29].
مطالعات زیادی نشان دادهاند که فلاونوئیدها و دیگر ترکیبات فنولی فعالیت آنتیکولین استرازی دارند [
30,
31]. دیهل و همکاران نشان دادند گالانتامین و فیزوستگمین دو ترکیب با ساختار آلکالوئیدی و منشأ گیاهی دارای اثرات مهارکنندگی آنزیم AChE هستند که از طریق افزایش استیلکولین باعث کاهش اعتیاد به سیگار میشوند [
32]. بنابراین ممکن است آلکالوئیدهای موجود در عصاره میوه عناب نیز باعث بروز خاصیت مهاری شوند، اما تحقیقات و مطالعه ما نشان داد عصاره اتانولی میوه عناب خاصیت فعالکنندگی استیل کولین استراز دارد. مطالعات هئو و همکارانش نشان داد، عصاره متانولی گیاه عناب بیشترین اثر فعالکنندگی را بر فعالیت استیلکولین استراز دارد و باعث کاهش سطح استیلکولین در پایانههای کولینرژیک میشود که با نتایج ما همخوانی دارد [
33]. مطالعات اینستروسا و همکارانش مکانیسم اثر حفاظتی عصارههای گیاهی در مهار آنزیم کولیناستراز را نشان داد [
34].
مطالعات نشان داد مواد شیمیایی اصلی عناب ساپونین شامل جوجوبوساید A، جوجوبوساید B و اسیدهای چرب شامل لوریک اسید، میریستیک اسید، پالمتیک اسید، اولئیک اسید، لینولئیک اسید، آراشیدونیک اسید [
35] و همچنین ترکیبات فنولی و فلاونوئیدها هستند که اثرات آنتیاکسیدانی را به این ترکیبات نسبت میدهند [
10]. نتایج مطالعه خیانکچون و همکارانش نشان داد که عصاره عناب میتواند با رادیکال آزاد ترکیب شده و اثرات توکسیک آن را کاهش دهد [
11]. مطالعات اندکی تأثیر میوه عناب را روی آنزیم SOD و CAT بررسی کردهاند. به نظر میرسد، دلایل ناهمخوانی نتایج دیگران با پژوهش حاضر، تفاوت در دُز مصرفی میوه عناب، نوع تزریق و طول دوره مصرفی عناب، نوع ماده تیمارشده و نوع بافت است. از جمله محدویتهای این تحقیق میتوان به کمبود نسبی تعداد نمونهها و گروههای تحقیق برای آزمایش دُزهای مختلف عناب اشاره کرد. پیشنهاد میشود از دُزهای مختلف میوه عناب و تعداد نمونه بیشتر برای جامعه آماری بزرگتر استفاده شود تا نتایج دقیقتری حاصل شود.
نتایج دادههای حاصل از این پژوهش نشان داد که تزریق درونصفاقی مورفین، سبب افزایش استرس اکسیداتیو، کاهش فعالیت آنزیم CAT، درصد بازدارندگی فعالیت آنزیم SOD و کاهش فعالیت آنزیم AChE میشود. تجویز عصاره عناب موجب بهبود استرس اکسیداتیو القاشده با مورفین و افزایش فعالیت آنزیم AChE شد، بنابراین تستهای بیوشیمیایی نشان داد عصاره عناب با دارا بودن خاصیت آنتیاکسیدانی و افزایش انتقال دهنده استیلکولین سبب افزایش فعالیت آنزیمهای CAT، SOD و AChE شد. نتایج این بررسی نشان میدهد که مصرف میوه عناب با توان آنتیاکسیدانی بالا میتواند یک عامل مهم و پیشگیریکننده در کاهش استرس اکسیداتیو و جلوگیری از بروز عوارض ناشی از آن باشد.
ملاحظات اخلاقی
پیروی از اصول اخلاق پژوهش
مطالعه حاضر توسط کمیته اخلاق زیستی دانشگاه مازندران تأیید شد (کد اخلاق: 1398.003 IR.UMZ.REC).
حامی مالی
این مقاله حاصل پایاننامه کارشناسی ارشد نویسنده اول در گروه زیست شناسی دانشگاه مازندران است.
مشارکت نویسندگان
مفهومسازی: باقر سید علیپور و فرهاد ولیزادگان؛ روششناسی، تحقیق و بررسی منابع، نگارش پیشنویس: زهرا هراتیان؛ بصریسازی، تحلیل دادهها، نگارش پیشنویس و ویراستاری، نظارت و مدیریت پروژه: باقر سید علیپور و فرهاد ولیزادگان.
تعارض منافع
بنابر اظهار نویسندگان این مقاله تعارض منافع ندارد.
تشکر و قدردانی
بدینوسیله از معاونت محترم پژوهشی دانشگاه مازندران به دلیل حمایتهای مالی تقدیر و تشکر میشود. همچنین از کارشناس آزمایشگاه خانم سارا رضایی که در امور آزمایش ما را یاری کردند تشکر میکنیم.
References
1.
Dhawan BN, Cesselin F, Raghubir R, Reisine T, Bradley PB, Portoghese PS, et al. International: :union:: of pharmacology. XII. Classification of opioid receptors. Pharmacological Reviews. 1996; 48(4):567-92. [PMID]
2.
Wang JH, Rizak JD, Chen YM, Li L, Hu XT, Ma YY. Interactive effects of morphine and dopaminergic compounds on spatial working memory in rhesus monkeys. Neuroscience Bulletin. 2013; 29(1):37-46. [DOI:10.1007/s12264-013-1305-3] [PMID] [PMCID]
3.
Wang J, Chen Y, Carlson S, Li L, Hu X, Ma Y. Interactive effects of morphine and scopolamine, MK-801, propranolol on spatial working memory in rhesus monkeys. Neuroscience Letters. 2012; 523(2):119-24. [DOI:10.1016/S0304-3940(96)13134-7] [PMID]
4.
Katona I, Sperlágh B, Sı́k A, Käfalvi A, Vizi ES, Mackie K. Presynaptically located CB1 cannabinoid receptors regulate GABA release from axon terminals of specific hippocampal interneurons. The Journal of Neuroscience. 1999; 19(11):4544-58. [DOI:10.1523/JNEUROSCI.19-11-04544.1999] [PMID] [PMCID]
5.
Naderi G, Hajhossini R, Abasi M, Mehrabian A. [Inhibitory effects of ethanolic extract of Cyperus rotandus on acetylcholinesrerase activity (Persian)]. Scientific Journal of Kurdistan University of Medical Sciences. 2015; 20(5):102-9. [DOI: 10.22102/20.5.102]
6.
Khalili M, Ebrahimzadeh MA. [A review on antioxidants and some of their common evaluation methods (Persian)]. Journal of Mazandaran University of Medical Sciences. 2015; 24(120):188-208. http://jmums.mazums.ac.ir/article-1-4858-en.html
7.
Khoshvaghti A, Darya GH, Hushmandi K, Musavi SM, Salami S. [The effect of Glaucium Flavum extract on the activity of three Liver and Kidney Oxido reductase enzymes in Alloxan induced diabetic rats: A short report (Persian)]. Journal of Rafsanjan University of Medical Sciences. 2019; 18(2):193-200. http://eprints.rums.ac.ir/6724/
8.
Khakdaman H, Pourmeydani A. [The study f Geografic distribution and Morphologic characters of Jujube in Iran (Persian)]. Iranian Journal of Medicinal and Aromatic Plants. 2004; 20(1):69-87. https://www.sid.ir/en/journal/ViewPaper.aspx?ID=113513
9.
Pahuja M, Mehla J, Reeta KH, Joshi S, Gupta YK. Hydroalcoholic extract of Zizyphus jujuba ameliorates seizures, oxidative stress, and cognitive impairment in experimental models of epilepsy in rats. Epilepsy & Behavior. 2011; 21(4):356-63. [DOI:10.1016/j.yebeh.2011.05.013] [PMID]
10.
Gao QH, Wu CS, Wang M. The jujube (Ziziphus jujuba Mill) fruit: a review of current knowledge of fruit composition and health benefits. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 2013; 61(14):3351-63. [DOI:10.1021/jf4007032] [PMID]
11.
Shen X, Tang Y, Yang R, Yu L, Fang T, Duan JA. The protective effect of Zizyphus jujube fruit on carbon tetrarch lorideinduced hepatic injury in mice by anti-oxidative activities. Journal of Ethnopharmacology. 2009; 122(3):555-60. [DOI:10.1016/j.jep.2009.01.027] [PMID]
12.
Karthishwaran K, Shamisi SO, Kurup SS, Sakkir S, Cheruth AJ. Free-radical-scavenging and antioxidant capacities with special emphasis on enzyme activities and in vitro studies in Caralluma flava N. E. Br. Biotechnology & Biotechnological Equipment. 2018; 32(1):156-62. [DOI:10.1080/13102818.2017.1379362]
13.
Taati M, Alirezaei M, Meshkatalsadat MH, Rasoulian B, Kheradmand A, Eamati Sh. Protective effects of Ziziphus jujuba fruit extract against ethanol-induced hippocampal oxidative stress and spatial memory impairment in rats. Journal of Medicinal Plants Research. 2011; 5(6):921-5. [doi:10.5897/JMPR.9001062]
14.
Awad DS, Ali RM, Mhaidat NM, Shotar AM. Shotar (2014) Zizyphusjujuba protects against ibuprofen-induced nephrotoxicity in rats. Pharmaceutical Biology. 2014; 52(2):182-6. [DOI:10.3109/13880209.2013.821665] [PMID]
15.
Etebari M, Zolfaghari B, Jafarian-Dehkordi A, Mirzaei A. Hydroalcoholic and polyphenolic extracts of Ziziphus jujuba mill fruits prevent methyl methanesulfonate-induced DNA damage in HepG2 cells. Pharmaceutical and Biomedical Research. 2015; 1(3):20-30. [DOI:10.18869/acadpub.pbr.1.3.20]
16.
Burden DW. Guide to the homogenization of biological samples. Random Primers. 2008; (7):1-14. https://opsdiagnostics.com/notes/ranpri/Homogenization%20Guide%20ver.1.pdf
17.
Aebi H. Catalase in vitro. Methods in Enzymology. 1984; 105:121-6. [DOI:10.1016/S0076-6879(84)05016-3]
18.
Li X. Improved pyrogallol autoxidation method: a reliable and cheap superoxide-scavenging assay suitable for all antioxidants. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 2012; 60(25):6418-24. [DOI:10.1021/jf204970r] [PMID]
19.
Benabent M, Vilanova E, Sogorb MÁ, Estévez J. Cholinesterase assay by an efficient fixed time endpoint method. MethodsX. 2014; 1:258-63. [DOI:10.1016/j.mex.2014.10.010] [PMID] [PMCID]
20.
Khorasani Esmaeili A, Mat Taha R, Mohajer S, Banisalam B. Antioxidant activity and total phenolic and flavonoid content of various solvent extracts from in vivo and in vitro grown Trifolium pratense L. (Red Clover). BioMed Research International. 2015; 2015:643285. [DOI:10.1155/2015/643285] [PMID] [PMCID]
21.
El Guiche R, Tahrouch S, Amri O, El Mehrach K, Hatimie A. Antioxidant activity and total phenolic and flavonoid contents of 30 medicinal and aromatic plants located in the South of Morocco. International Journal of New Technology and Research. 2015; 1(3):7-11. https://www.neliti.com/publications/263695/antioxidant-activity-and-total-phenolic-and-flavonoid-contents-of-30-medicinal-a
22.
Xu B, Wang Z, Li G, Li B, Lin H, Zheng R, et al. Heroin administered mice involved in oxidative stress and exogenous antioxidant alleviated withdrawal syndrome. Basic & Clinical Pharmacology & Toxicology. 2006; 99(2):153-61. [DOI:10.1111/j.1742-7843.2006.pto_461.x] [PMID]
23.
Hassanzadeh K, Habibi-asl B, Farajnia S, Roshangar L. Minocycline prevents morphine-induced apoptosis in rat cerebral cortex and lumbar spinal cord: a possible mechanism for attenuating morphine tolerance. Neurotoxicity Research. 2011; 19(4):649-59. [DOI:10.1007/s12640-010-9212-0] [PMID]
24.
Jin H, Li YH, Xu JS, Guo GQ, Chen DL, Bo Y. Lipoxin A4 analog attenuates morphine antinociceptive tolerance, withdrawal-induced hyperalgesia, and glial reaction and cytokine expression in the spinal cord of rat. Neuroscience. 2012; 208:1-10. [DOI:10.1016/j.neuroscience.2012.02.009] [PMID]
25.
Hemnani A, Parihar MS. Reactive oxygen species and oxidative DNA damage. Indian Journal of Physiology and Pharmacology. 1998; 42:440-52. [PMID]
26.
Konrath EL, Neves BM, Lunardi PS, Dos Santos Passos C, Simões-Pires A, Ortega MG. Investigation of the in vitro and ex vivo acetylcholinesterase and antioxidant activities of traditionally used Lycopodium species from South America on alkaloid extracts. Journal of Ethnopharmacology. 2012; 139(1):58-67. [DOI:10.1016/j.jep.2011.10.042] [PMID] https://ijpp.com/
27.
De Freitas V, Da Silva Porto P, Assuncao M, Cadete-Leite A, Andrade JP, Paula-Barbosa MM. Flavonoids from grape seeds prevent increased alcohol-induced neuronal Lipofuscin formation. Alcohol and alcoholism. 2004; 39(4):303-11. [DOI:10.1093/alcalc/agh069] [PMID]
28.
Gonenc S, Uysal N, Acikgoz O, Kayatekin BM, Sonmez A, Kiray M. Effects of Melatonin on oxidative stress and spatial memory impairment induced by acute ethanol treatment in rats. Physiological Research. 2005; 54(3):341-8. https://europepmc.org/article/med/15588163
29.
Soliman KF, Gabriel NN. Brain cholinergic involvement in the rapid development of tolerance to the hypothermic action of ethanol. General Pharmacology. 1985; 16(2):137-40. [DOI:10.1016/0306-3623(85)90051-5]
30.
Hostettmann K, Borloz A, Urbain A, Marston A. Natural product inhibitors of Aetylcholinesterase. Current Organic Chemistry. 2006; 10(8):825-47. [DOI:10.2174/138527206776894410]
31.
Hernandez MF, Fale PL, Araujo ME, Serralheiro ML. Acetyl-cholinesterase inhibition and antioxidant activity of the water extracts of several Hypericum species. Food Chemistry. 2010; 120(4):1076-82. [DOI:10.1016/j.foodchem.2009.11.055]
32.
Diehl A, Nakovics H, Croissant B, Smolka MN, Batra A, Mann K. Galantamine reduces smoking in alcohol-dependent patients: a randomized, placebo-controlled trial. International Journal of Clinical Pharmacology and Therapeutics. 2006; 44(12):614-22. [DOI:10.5414/CPP44614] [PMID]
33.
Heo HJ, Park YJ, Suh YM, Choi SJ, Kim MJ, Cho HY. Effects of oleamide on choline acetyltransferase and cognitive activities. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 2003; 67(6):1284-91. [DOI:10.1271/bbb.67.1284] [PMID]
34.
Inestrosa NC, Urra S, Colombres M. Acetylcholinesterase (AChE)-amyloid-β-peptide complexes in Alzheimer’s disease. The Wnt signaling pathway. Current Alzheimer Research. 2004; 1(4):249-54. [DOI:10.2174/1567205043332063] [PMID]
35.
Zhao J, Li SP, Yang FQ, Li P, Wang YT. Simultaneous determination of saponins and fatty acids in Ziziphus jujuba (Suanzaoren) by high performance liquid chromatography-evaporative light scattering detection and pressurized liquid extraction. Journal of Chromatography A. 2006; 1108(2):188-94. [DOI:10.1016/j.chroma.2005.12.104] [PMID]