مقدمه
صرع یک اختلال عصبی مزمن شایع است که بیش از 50 میلیون نفر در سراسر جهان را تحت تأثیر قرار می دهد. با وقوع متناوب تشنج‌ها مشخص می‌شود که عملکرد طبیعی مغز را مختل می‌کند. میکروگلیا به‌عنوان سلول‌های ایمنی اصلی مغز، نقش مهمی در توسعه و نگهداری مدارهای عصبی در طول رشد و بزرگسالی ایفا می‌کند که بعید است با انواع سلول‌های دیگر جایگزین شوند. علی‌رغم اطلاعات زیادی که در مورد خواص میکروگلیال در شرایط فیزیولوژیکی وجود دارد، اطلاعات کمی در مورد اینکه آیا و چگونه میکروگلیا ساختار و عملکرد مدارهای عصبی را در شرایط صرع تعدیل می‌کند، وجود دارد. 
میکروگلییاها، در صرع به‌سرعت در نواحی مغزی که تحت تأثیر محرک‌های تشنجی قرار دارند، فعال می‌شوند. فعال‌سازی میکروگلیا همراه با فعال‌سازی آستروسیتی احتمالاً به فرآیند صرع در مدل‌های حیوانی صرع کمک می‌کند [1]. ازطرفی مشخص شده است آستروسیت‌ها در تحریکی که به تشنج منجر می‌شود، نقش دارند. تصور بر این است که فعالیت هم‌زمان عصبی در تشنج از یک منشأ کاملاً عصبی ناشی نمی‌شود، زیرا درمان بافت هیپوکامپ و قشر مغز با ترکیباتی که باعث القای تشنج می‌شوند، تحریک مستقیم آستروسیت‌ها ازطریق مسیری را نشان می‌دهد که باعث ترشح گلوتامات از گلیال می‌شود و اینکه داروهای ضدتشنج، فعالیت این مسیر غیرعصبیی را کاهش می‌دهند [2]. 
مطالعات 20 سال گذشته نشان می‌دهد آستروسیت‌ها یک سری عملکردهای پیچیده را انجام می‌دهند که فراتر از برداشت و بازیافت انتقال‌دهنده‌های عصبی است. آستروسیت‌ها به‌عنوان سلول‌های غیرقابل تحریک در نظر گرفته می‌شوند، زیرا برخلاف نورون‌ها، پتانسیل‌های عمل ایجاد نمی‌کنند، آن‌ها نوعی تحریک‌پذیری را نشان می‌دهند که براساس تغییرات غلظت کلسیم درون سلولی است. آستروسیت‌ها بخش جدایی‌ناپذیر و فعال انتقال سیناپسی تحریکی و مهاری را تشکیل می‌دهند و با سیناپس‌ها ارتباط برقرار می‌کنند. شواهد جدید نقش مهمی را برای این سلول‌های گلیال در پاتوژنز اختلالات عصبی مانند صرع پیشنهاد کرده‌اند [3]. در ضمن مشخص شده است که ارتباطات دو طرفه بین آستروسیت‌ها و سلول‌های عصبی برای عملکرد طبیعی سیستم عصبی در طی پردازش سیگنال ضروری است. آستروسیت‌ها توسط اتصالات شکاف به هم وصل می‌شوند تا یک سینسیتیوم عملکردی بزرگ را تشکیل دهند [4]. 
تغییرات هورمونی هم به‌دنبال فعالیت‌های تشنجی مختلف ممکن است اتفاق بیافتد. برای مثال، بعد از تشنج‌های کمپلکس پارشیال و عمومی تونیک کلونیک مقدار پرولاکتین در دوسوم موارد افزایش دارد [5]. پرولاکتین هورمونی است که در سیستم عصبی مرکزی عملکردهای متعدد دارد [6] و باعث فعال شدن و سرکوب میکروگلیا و آستروسیت‌ها و ترشح سیتوکین‌های التهابی و ضدالتهابی می‌شود [7]. پرولاکتین ازطریق گیرنده‌های پرولاکتین که در سلول‌های عصبی و سلول‌های گلیال مغز یافت می‌شوند، عمل می‌کند و ازطریق این گیرنده‌ها اعمال متفاوت خودش را در این قسمت‌ها انجام می‌دهد. چون حضور پرولاکتین می‌تواند باعث فعال شدن سلول‌های گلیال شود، بنابراین با در نظر گرفتن دینامیک این سلول‌ها و عملکردشان در شرایط مختلف به‌علاوه اثرات حفاظتی پرولاکتین در سلول‌های عصبی، می‌توان پرولاکتین را به‌عنوان هدف جدید و متفاوت در نوروپاتولوژی بیماری‌های عصبی مورد بررسی و مطالعه قرار داد [8]. 
مطالعات قبلی نشان می دهند بین پرولاکتین و آسیب عصبی در بیماری صرع و مدل تجربی آن ارتباط وجود دارد. هرچند این ارتباط در شرایط آسیب عصبی بیشتر از نوع حفاظتی است [7]. شواهد نشان می‌دهند در صرع وضعیتی انسان، سلول‌های پیرامیدال هیپوکامپ از دست می‌روند و در پاتوژنز بیماری صرع، التهاب عصبی و سلول‌های گلیال دخالت دارند، بنابراین جای امیدواری است که با هدف قرار دادن این سلول‌ها بتوان استراتژی‌های درمانی موجود را کامل کرد؛ به‌ویژه اینکه میکروگلیا به‌عنوان یک سلول التهابی عمده در مغز صرعی، کمتر مورد مطالعه قرار گرفته است [9]. 
بنابراین با در نظر گرفتن تعاملات بین نورون‌ها و نوروگلیا و احتمال افزایش پرولاکتین به‌دنبال فعالیت‌های مزمن تشنجی [10] ناشی از پنتیلن تترازول1 این مطالعه با هدف مقایسه اثرات کابرگولین (داروی مورداستفاده برای درمان پرولاکتین بالا) و لوتیراستام (داروی ضدتشنج) بر تغییرات بافتی و استریولوژیک کورتکس، هیپوکامپ و مخچه انجام شد.
روش‌ها
حیوانات 
در این مطالعه تجربی، 30 سر موش صحرایی ماده بالغ از محل پرورش و نگهداری حیوانات آزمایشگاهی واقع در دانشکده داروسازی دانشگاه علوم‌پزشکی ارومیه خریداری شدند. سپس برای انطباق‌پذیری با شرایط آزمایشگاهی به بخش حیوان‌خانه آزمایشگاه فارماکولوژی دانشکده دامپزشکی دانشگاه تبریز انتقال یافتند. 
گروه‌های مورد مطالعه
حیوانات مورد مطالعه به‌صورت کاملاً تصادفی در 5 گروه کنترل (نرمال‌سالین)، تشنج مزمن، تشنج مزمن+لوتیراستام، تشنج مزمن+کابرگولین و تشنج مزمن+لوتیراستام+کابرگولین دسته‌بندی شدند. در هر گروه از 6 سر موش صحرایی ماده بالغ استفاده شد. در گروه تشنج به‌مدت 10 هفته، هر هفته 3 روز (در روزهای شنبه، دوشنبه و چهارشنبه) تزریق داخل‌صفاقی 30 میلی‌گرم بر کیلوگرم پنتیلن‌تترازول انجام شد [11] که به این ترتیب موش‌ها به‌صورت مزمن دچار تشنج شدند. 
در گروه‌های درمانی دیگر، همراه با برنامه تزریق داخل‌صفاقی پنتیلن‌تترازول طی زمان 10 هفته پشت سر هم، از دارو‌های لوتیراستام به مقدار 50 میلی‌گرم بر کیلوگرم [12] (تشنج مزمن+ لوتیراستام)، کابرگولین به مقدار 0/05 میلی‌گرم بر کیلوگرم [13] (تشنج مزمن+کابرگولین) و نیز ترکیب لوتیراستام+کابرگولین (تشنج مزمن+لوتیراستام 25 میلی‌گرم بر کیلوگرم+کابرگولین 0/025 میلی‌گرم بر کیلوگرم) به‌روش گاواژ خوراکی استفاده شد. برای تهیه غلظت‌های مورد نظر کابرگولین و لوتیراستام و همچنین تهیه پنتیلن‌تترازول از نرمال‌سالین استفاده شد. بعد از آنکه مدت‌زمان 10 هفته سپری شد، با رعایت تمامی موازین اخلاقی، حیوانات با ترکیب کتامین+زایلازین (70+7 میلی‌گرم بر کیلوگرم) بیهوش شدند. بعد از اینکه از یوتانازی موش‌ها اطمینان حاصل شد، سر آن‌ها از بدن جدا شد و سپس مغز و مخچه حیوانات مذکور به ‌ور کامل از بدن خارج شد. برای تثبیت بافتی، مغز موش‌ها در محلول فرمالین 10 درصد برای انجام مطالعات بافت‌شناسی و استریولوژیک قرار داده شد.
آماده‌سازی بافتی
پس از تثبیت نمونه‌ها برای مطالعه بافت‌شناسی و استریولوژیک در 3 ناحیه هیپوکامپ، مخچه و قشر مخ، مراحل استاندارد تهیه مقاطع بافتی که شامل آب‌گیری، شفاف‌سازی و آغشتگی با پارافین است، طی شد و بدین‌ترتیب بلوک‌های پارافینی آماده شدند. در مرحله بعد با استفاده از میکروتوم دورانی از هر بلوک برش‌های سریالی تهیه شد. برای انجام این کار اصل انتخاب تصادفی یکنواخت و منظم به‌صورت 10 برش 5 میکرونی به منظور مطالعات بافت‌شناسی و تهیه تصاویر میکروسکوپی لحاظ شد و 5 تا 7 برش 50 میکرونی با رعایت فاصله‌های 300 میکرونی انتخاب شد تا رنگ‌آمیزی هماتوکسیلین‌ـ‌ائوزین به روش استاندارد و معمول انجام شود. 
مطالعات استریولوژیک
تمامی فرایند مطالعه استریولوژیک و نیز تخمین تراکم سلول‌های عصبی و نوروگلیاها توسط سیستم رایانه‌ای تجهیزشده با نسخه شماره 9 در نرم‌افزار استررئواینوستیگیتور اجرا شد. طی مطالعات استریولوژیک تراکم سلول‌ها به شیوه فراکشنیتور توسط قاب شمارش با ابعادی مطلوب در 3 بخش مخچه، هیپوکامپ و کورتکس تخمین زده شد [14].
در مطالعه حاضر برای انجام تمام مراحل پاساژ بافتی همچون آبگیری، شفاف‌سازی و آغشته‌سازی از دستگاهی به نام هیستوکینت (مدل 2000، آلمان) استفاده شد. بعد از اینکه تثبیت‌سازی انجام شد، نمونه‌های بافتی میزان زیادی آب داشتند که برای آغشتگی در این مرحله از پارافین که کاملاً آب‌گریز است، استفاده شد. آب بافت با استفاده از غلظت‌های 50، 70، 80 و 90 الکل‌اتیلیک در زمان 1 ساعت در 2 ظرف الکل و در هرکدام به مدت‌زمان 2 ساعت خارج شد. 
ازآنجاکه الکل‌اتیلیک امکان مخلوط شدن با پارافین مذاب را ندارد، بنابراین باید پیش از عمل آغشتگی، بافت را در محلول شفافی همچون گزیلول که حلال پارافین است، قرار داد. در طی آغشته‌سازی، نمونه‌های بافتی در پارافین مذاب (56 الی 58 درجه سانتی‌گراد) گذاشته شدند. در مرحله آغشته‌سازی پارافین داخل بافت شده که این کار باعث استحکام‌بخشی ساختار بافتی و تسهیل ایجاد برش‌های نازک از بافت می‌شود. برای آغشتگی نمونه‌ها می‌توان از 2 ظرف حاوی پارافین و هرکدام در مدت‌زمان 2 ساعت استفاده کرد. به منظور قالب‌گیری، از قطعات فلزی L شکل استفاده شد که قطعات لوکهارت نامیده می‌شوند. در این هنگام ابتدا پارافین مذاب در داخل قالب ریخته شد و به‌دنبال آن باتوجه‌به خط‌مشی استریولوژیکی از پیش تعیین‌شده نمونه بافتی به داخل قالب اضافه شد [15]. 
رنگ‌آمیزی
به دنبال انجماد پارافین، مقطع‌گیری آغاز شد و با استفاده از میکروتوم دورانی برش‌های نازک با ضخامت 5 میکرومتر به منظور مطالعات هیستولوژی و ایمونوهیستوشیمی و برش‌های ضخیم با ضخامت 20 میکرومتر به منظور مطالعات استریولوژیک بر روی نمونه‌های حاضر در قالب‌های پارافینی ایجاد شد. جهت از بین بردن چین و چروک برش‌ها ابتدا آن‌ها روی سطح آب گرم قرار گرفتند و به دنبال آن لام‌های حاوی چسب گلیسروآلبومین به قسمت پایینی برش‌های صاف‌شده برده شد و سپس برش‌ها از سطح آب برداشته شدند، خشک و رنگ‌آمیزی شدند. به‌طور معمول در برش‌های بافتی از رنگ‌آمیزی هماتوکسیلین‌ـ‌ائوزین استفاده می‌شود که در آن هسته سلول به رنگ بنفش و سیتوپلاسم آن به رنگ صورتی درمی‌آید. 
در مطالعه حاضر از هماتوکسیلین هاریس و ائوزین الکلی استفاده شد. به این صورت که مقاطع در مدت‌زمان 15 دقیقه در 2 ظرف گزیلول قرار داده شدند تا پارافین حل شود که به آن پارافین‌گیری می‌گویند، سپس نمونه‌ها به‌مدت 1 دقیقه در الکل‌اتیلیک قرار داده شدند تا جلوی آسیب رسیدن به نمونه‌ها گرفته شود که به آن آب‌دهی می‌گویند. بعد از آب‌دهی، نمونه‌ها 15 دقیقه در رنگ هماتوکسیلین قرار گرفتند و سپس چند ثانیه در محلول اسید الکل قرار گرفتند تا مازاد رنگ هماتوکسیلین بیرون رود. 
 عمل شست‌وشو تا پدیدار شدن رنگ آبی ادامه یافت که در انجام این کار محلول کربنات لیتیوم باعث سرعت‌بخشی به آن شد. پس از شست‌وشو، مقاطع در زمان 5 دقیقه در محلول 1 درصد ائوزین مانده و مجدداً شست‌وشو داده شدند. به منظور آبگیری، مقاطع بافتی به مدت 1 دقیقه در الکل‌اتیلیک ماند و با قرار گرفتن در 2 ظرف حاوی گزیلول در طی زمان 15 دقیقه شفاف شدند. پس از پایان مراحل رنگ‌آمیزی، مقاطع از گزیلول بیرون آورده شد و با ریختن 2 قطره چسب انتلان روی برش، با نهایت دقت به صورتی که چسب به‌طور یکسان در همه جا پخش شود و هیچ اثری از تشکیل حباب وجود نداشته باشد، لامل روی آن جای گرفت. در این حالت لام، خشک و آماده مطالعات میکروسکوپیک شد [15]. 
تحلیل داده‌ها
در مطالعه حاضر مقادیر متغیرهای کمی به‌صورت میانگین±انحراف‌معیار نشان داده شد. برای مقایسه میانگین متغیرهای مورد بررسی بین گروه‌ها از تحلیل واریانس یک‌طرفه و آزمون تعقیبی توکی استفاده شد. داده‌ها با استفاده از نسخه 27 نرم‌افزار SPSS تجزیه‌وتحلیل شدند و سطح معنا‌داری 0/05 در نظر گرفته شد.
یافته‌ها
کورتکس مغزی
بررسی نتایج نشان داد استفاده مزمن لوتیراستام و کابرگولین و ترکیب این دو به‌صورت گاواژ همزمان با القای فعالیت‌های تشنجی توسط مدل کیندلینگ تشنجی ناشی از PTZ در موش صحرایی، تعداد نورون‌ها و نوروگلیا را در کورتکس مغزی به‌طور معنا‌داری در مقایسه با گروه کنترل تغییر نداده است  (0/05<P تصویر شماره 1).
 

References
1.Hiragi T, Ikegaya Y, Koyama R. Microglia after seizures and in epilepsy. Cells. 2018; 7(4):26. [DOI:10.3390/cells7040026] [PMID] [PMCID]
2.Fellin T, Haydon PG. Do astrocytes contribute to excitation underlying seizures? Trends in Molecular Medicine. 2005; 11(12):530-3. [DOI:10.1016/j.molmed.2005.10.007] [PMID]
3.Clasadonte J, Haydon PG. 46 astrocytes and epilepsy. In: Noebels J, editor. Jasper's basic mech epilepsies. Oxford: Oxford Academic; 2012. [DOI:10.1093/med/9780199746545.003.0046]
4.Amiri M, Bahrami F, Janahmadi M. On the role of astrocytes in epilepsy: A functional modeling approach. Neuroscience Research. 2012; 72(2):172-80. [DOI:10.1016/j.neures.2011.11.006] [PMID]
5.Bauer J. Interactions between hormones and epilepsy in female patients. Epilepsia. 2001; 42 (Suppl 3):20-2. [DOI:10.1046/j.1528-1157.2001.042suppl.3020.x] [PMID]
6.Bole-Feysot C, Goffin V, Edery M, Binart N, Kelly PA. Prolactin (PRL) and its receptor: Actions, signal transduction pathways and phenotypes observed in PRL receptor knockout mice. Endocrine Reviews. 1998; 19(3):225-68. [DOI:10.1210/edrv.19.3.0334] [PMID]
7.Henkel ND, Smail MA, Wu X, Enright HA, Fischer NO, Eby HM, et al. Cellular, molecular, and therapeutic characterization of pilocarpine-induced temporal lobe epilepsy. Scientific Reports. 2021; 11(1):19102. [DOI:10.1038/s41598-021-98534-3] [PMID] [PMCID]
8.Anagnostou I, Reyes-Mendoza J, Morales T. Glial cells as mediators of protective actions of prolactin (PRL) in the CNS. General and Comparative Endocrinology. 2018; 265:106-10. [DOI:10.1016/j.ygcen.2018.01.024] [PMID]
9.DeGiorgio CM, Tomiyasu U, Gott PS, Treiman DM. Hippocampal pyramidal cell loss in human status epilepticus. Epilepsia. 1992; 33(1):23-7. [DOI:10.1111/j.1528-1157.1992.tb02278.x] [PMID]
10.Fisher RS. Serum prolactin in seizure diagnosis: Glass half-full or half-empty? Clinical Practice. 2016; 6(2):100-1. [DOI:10.1212/CPJ.0000000000000228] [PMID] [PMCID]
11.Dhir A. Pentylenetetrazol (PTZ) kindling model of epilepsy. Current protocols in neuroscience. 2012; Chapter 9:Unit9.37.[DOI:10.1002/0471142301.ns0937s58] [PMID]
12.Talos DM, Chang M, Kosaras B, Fitzgerald E, Murphy A, Folkerth RD, et al. Antiepileptic effects of levetiracetam in a rodent neonatal seizure model. Pediatric Research. 2013; 73(1):24-30. [DOI:10.1038/pr.2012.151] [PMID] [PMCID]
13.Kharlip J, Salvatori R, Yenokyan G, Wand GS. Recurrence of hyperprolactinemia after withdrawal of long-term cabergoline therapy. The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 2009; 94(7):2428-36. [DOI:10.1210/jc.2008-2103] [PMID] [PMCID]
14.Walløe S, Pakkenberg B, Fabricius K. Stereological estimation of total cell numbers in the human cerebral and cerebellar cortex. Frontiers in Human Neuroscience. 2014; 8:508. [DOI:10.3389/fnhum.2014.00508] [PMID] [PMCID]
15.Golub VM, Brewer J, Wu X, Kuruba R, Short J, Manchi M, et al. Neurostereology protocol for unbiased quantification of neuronal injury and neurodegeneration. Frontiers in Aging Neuroscience. 2015; 7:196. [DOI:10.3389/fnagi.2015.00196] [PMID] [PMCID]
16.Shukla G, Bhatia M, Vivekanandhan S, Gupta N, Tripathi M, Srivastava A, et al. Serum prolactin levels for differentiation of nonepileptic versus true seizures: Limited utility. Epilepsy & Behavior. 2004; 5(4):517-21. [DOI:10.1016/j.yebeh.2004.03.004] [PMID]
17.Parpura V, Heneka MT, Montana V, Oliet SH, Schousboe A, Haydon PG, et al. Glial cells in (patho) physiology. Journal of Neurochemistry. 2012; 121(1):4-27. [DOI:10.1111/j.1471-4159.2012.07664.x] [PMID] [PMCID]
18.Amiri M, Bahrami F, Janahmadi M. Functional contributions of astrocytes in synchronization of a neuronal network model. Journal of Theoretical Biology. 2012; 292:60-70. [DOI:10.1016/j.jtbi.2011.09.013] [PMID]
19.Holmes GL, Gairsa JL, Chevassus-Au-Louis N, Ben-Ari Y. Consequences of neonatal seizures in the rat: Morphological and behavioral effects. Annals of Neurology. 1998; 44(6):845-57. [DOI:10.1002/ana.410440602] [PMID]
20.Eyo UB, Murugan M, Wu L. Microglia-neuron communication in epilepsy. Glia. 2017; 65(1):5-18. [DOI:10.1002/glia.23006] [PMID] [PMCID]